哈蟆油薄层色谱定性研究

　　【摘要】 目的采用薄层定性的方法对哈蟆油进行薄层色谱研究。方法对哈蟆油在不同极性的溶剂、不同提取方法、不同显色剂，展开条件下薄层色谱行为进行研究。结果对哈蟆油的薄层色谱行为有了初步的了解。结论建立了不同极性范围内的哈蟆油薄层色谱图。

　　【关键词】 哈蟆油； 薄层色谱

　　Abstract：ObjectiveTo study Oviductus Ranae by thin-layer chromatography. MethodsThin-layer chromatography complexion of Oviductus Ranae with different pole solvents, different extraction methods, different visualizing reagents and different developing solvents. ResultsThe thin-layer chromatography complexion of Oviductus Ranae had preliminary acquaintance.ConclusionThe different pole range of thin-layer chromatograms of Oviductus Ranae is set up.

　　Key words：Oviductus Ranae; TLC

　　哈蟆油（Oviductus Ranae）为蛙科动物中国林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的输卵管，经采制干燥而得，具有补肾益精、养阴润肺的功效。临床用于治疗阴虚体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗不止，痨嗽咳血［1］。薄层层析法也称薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC)，是快速分离和定性分析少量物料的一种非常重要的技术，与经典的分离提纯手段（重结晶、升华、萃取和蒸馏等）相比，薄层色谱法具有微量、快速、分离效率高和灵敏度高等优点［2］，自20世纪50年代建立该方法以来，在很多方面得到了广泛的应用，如判断有机合成反应进行的程度，合成药物的质量控制及杂质检查，中草药的分离提纯和鉴别，药物分析及含量测定等。近年来，尽管其他色谱技术发展迅速，但薄层色谱的应用并没有明显减少，反而随着新的固定相和高速发展的仪器技术的引入，呈现出愈加重视的势头，并成为一种现代的、灵敏的、高效的分离分析方法，是控制中药质量的良好方法。本文报道哈蟆油的TLC定性鉴别。

　　1 器材

　　1.1 药材正品哈蟆油药材，经本院生药教研室姜大成教授鉴定为蛙科动物中国林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的输卵管，经采制干燥而得，符合《中国药典》2005年版Ⅰ部哈蟆油项下规定。见表1。

　　表1 正品哈蟆油药材TLC指纹图谱研究供试样品（略）

　　1.2 试剂 胆固醇对照品，（10-1491-79，北京化工厂）；硅胶G（青岛海洋化工厂）；氯仿、甲醇、乙醇、醋酸乙酯、正己烷、丙酮、正丁醇、乙醚、石油醚、冰醋酸（均为分析纯）。

　　1.3 仪器超声波提取器 （KQ-100B，昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（T-500，常熟双杰测试仪器厂）；双相展开槽（P- 上海信谊仪器厂）；电动显色设备（YOKO-PN，武汉药科新技术开发公司）；电水浴锅（HH-2 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司）；紫外分析仪（EF-I，上海顾村电光仪器厂）；数码相机（Nikon E5600，510万有效像素）。

　　2 方法与结果

　　2.1 供试品溶液的制备

　　2.1.1 提取溶剂的选择和确定据报道，哈蟆油的化学成分有水溶性的和脂溶性的，根据其成分选择用不同极性的溶剂进行梯度提取，分别研究不同极性范围的哈蟆油薄层效果。主要有石油醚、氯仿（乙醚）、醋酸乙酯（正丁醇）、乙醇（丙酮）4个梯度。结果4个梯度的溶剂提取物的薄层效果没有显著的区别，区别仅在于极性稍大的溶剂的色谱斑点较少，其所有的斑点均能体现在极性较小的提取物的薄层板上。经过多种色谱条件的优选，以氯仿提取物的斑点较多，颜色较深。

　　2.1.2 提取方法的选择和确定分别采用超声提取法、回流提取法、连续回流提取法、浸渍法、硅胶柱色谱、萃取法。薄层跟踪的结果显示采用超声提取法和回流提取法的效果较好，两者没有明显的区别，考虑到超声提取法省时省力，设备先进，故选用了超声提取法。同时对超声提取时间进行了考察，结果超声提取10，20，30，40 min没有明显的区别，考虑节省时间、对仪器的损耗、提取更充分，选用了超声提取20 min。

　　2.2 对照品溶液的选择和确定先后选用了胆固醇、十六烷酸胆甾醇酯、1-甲基海因以及各类氨基酸作为对照品。结果以胆固醇和十六烷酸胆甾醇酯作为对照品在各个提取物中效果都很好，且Rf值适中。

　　2.3 吸附剂的选择和确定吸附剂是影响薄层效果的重要因素之一，常用的吸附剂主要有硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、中性氧化铝、聚酰胺薄膜，在相同的实验条件下分别比较了上述几种吸附剂的薄层效果，结果以硅胶G为吸附剂色谱斑点无拖尾现象且色谱斑点较多。

　　2.4 展开剂的选择和确定采用了数值分析法、棱柱形法、均匀设计法等，结合哈蟆油所含成分的性质和结构。从上百种展开剂中优选，结果以石油醚∶醋酸乙酯∶丙酮∶冰醋酸（10∶1∶1∶1）、石油醚∶醋酸乙酯∶丙酮∶甲醇（10∶1∶2∶1）、石油醚∶丙酮∶正己烷∶冰醋酸（8∶1∶1∶1）、石油醚∶正己烷∶冰醋酸（6∶1∶2）、石油醚∶正己烷∶乙酸乙酯∶氯仿∶冰醋酸（9∶2∶1∶1）、石油醚∶冰乙酸（4∶1)、石油醚∶丙酮∶冰醋酸（6∶1∶1）、正己烷∶丙酮∶冰醋酸（8∶2∶1）、石油醚∶乙醚∶甲酸（10∶6∶1）、石油醚∶醋酸乙酯（8∶1）、石油醚∶醋酸乙酯∶正己烷（8∶1∶1）、石油醚∶氯仿∶正己烷（1∶6∶6）展开效果较好，分离度高，斑点较多，且没有拖尾现象，部分色谱图如图1。

　　图1 哈蟆油薄层色谱图（略）

　　2.5 显色剂的选择和确定显色剂考察了荧光灯（365 nm，254 nm）、改良碘化铋钾、硫酸乙醇、磷钼酸乙醇、香草醛试液、茴香醛试液、3，5－二硝基苯肼乙醇试液、对二甲氨基苯甲醛试液。结果以磷钼酸乙醇和硫酸乙醇为显色剂，显色的斑点较多，颜色分明。

　　2.6 展开方式的选择和确定展开方式选用了上行法、下行法、双向展开法、二次展开法，分别考察了10 cm×10 cm和10 cm×20 cm的薄层板，结果采用10 cm×10 cm的硅胶G板，二次展开后的分离效果更好，斑点也更清晰。

　　3 讨论

　　本研究曾对文献报道的有关哈蟆油的薄层色谱鉴别进行了考察，结果在薄层板上显现的斑点较少。基于本原因，作者对哈蟆油的薄层色谱进行了系统的研究，从提取溶剂的选择到提取方法，展开剂，显色剂，吸附剂以及展开方式的优选都做了比较研究。

　　由于极性较小的溶剂提取效率较好，本实验还对正己烷，环己烷，苯和甲苯提取物进行了研究，苯和甲苯提取物与环己烷和正己烷提取物的薄层效果没有明显的区别，同时由于苯和甲苯是一类试剂，环己烷和正己烷的极性与石油醚、乙醚的极性相当，提取物的效果也没有明显的区别，因此没有列出环己烷和正己烷提取物及其相应的展开剂系统。

　　在哈蟆油的近百种展开剂的优选中，对哈蟆油药材的薄层色谱行为有了一定的掌握，同时对哈蟆油所含成分的极性和溶解性有了更进一步的了解，为以后的研究工作提供了依据。

　　本研究首次全面考察了哈蟆油薄层色谱条件，确立了快速、直观、操作简便的鉴别哈蟆油药材自身的薄层色谱条件，为更好地控制哈蟆油的质量提供了依据。同时为进一步研究哈蟆油的薄层色谱指纹图谱以及同其它的色谱光谱联用技术提供了前提条件。

　　【参考文献】

　　［1］ 国家药典委员会．中国药典［S］．北京：化学工业出版社，2005：179.

　　［2］ 陈 宁. 薄层色谱技术新进展［J］.广东公安科技, 2000, (2):12.