血细胞常用的染色方法

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细胞涂片，在用普通光学显微镜观察之前需要固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持其原有结构不发生变化。染色的目的是使细胞的主要结构，如细胞质、细胞核、细胞器等染上不同的颜色，便于显微镜下观察。各种细胞涂片，常用的染色方法有瑞氏（Wright）、姬姆萨（Giemsa）、巴氏（PaPanicolaou）和苏木素一伊红比emat0Xylineosin，HE）染色。

一、染料与染色

染料（dyes）是一种具有颜色的有机化合物，最早用于织物的着色。随着生物医学的不断发展，显微镜技术的出现和逐步完善，科学家们用染料将生物组织细胞和病原体着色，以利在显微镜下观察各种结构，这种染料称为生物学染色剂（biologystains，BS），生物染色剂的发现和利用促进了医学生物学的进一步发展。

（一）细胞学的基本染料

染料可分为两大类，即天然染料和人工合成染料。生物染色剂多属于后者。各种生物学染色剂都具有产生颜色和与被染组织亲合两种性质。这两种性质主要由两种特殊基团即发色基团（chromophoro）和助色基团（auxochrome）所产生。

所谓发色基团，是染料产生颜色标志的未饱和基团。不同的有机化合物可以吸收不同波长的光，如吸收可见光区以外的光，这些物质是无色的；如吸收可见光区内某些波长的光，这些物质是有色的，其肉眼可见的颜色为被吸收光颜色的互补色。一般饱和芳香族化合物很少有可见光区的吸收带，因而无颜色可见。相反，如苯的衍生物则具有此吸收带而呈现颜色。这些化合物显示的吸收带与不稳定价键（如π键）有关。对苯二酚是无色的，但氧化失去两个氢原子时变为具黄色的对醌式结构，这种使有机化合物在可见光区内产生光吸收的基团称为发色基团，常见的发色基团有烯基、炔基、羰基、偶氮基、亚硝基等。助色基团是一种能使化合物发生电离作用的辅助原子团，能与发色基团构成更完整的共轭体系，使分子激发能进一步降低，染料的色泽加深并使其与被染组织更具亲合力，染料的助色基团是使染料成为盐类的部分，助色基团的性质决定染料在水溶液中的荷电性，常见的助色基团有羟基、竣基、氨基等。根据助色基团的性质，将生物学染色剂分成碱性染料和酸性染料两大类，即能接受质子者为碱性染料，能释放质子者为酸性染料。

1、碱性染料（basicdyes） 属苯胺类蓝色染料，如噻嗪（thiazins）系列，包括亚甲蓝（methyleneblue）、天青A（azure A）、天青B（azureB）、天青C（azureC）和硫堇（thionine），它们的区别在于结合甲基的数量。以天青B为例，它含有两个发色基团，一个次氨基（－N一）和一个邻醌式基团。助色基团为氨基（一NH2），结合一个质子后荷正电，亦称阳离子染料。因此，这些染料与细胞内的酸性成分，如DNA、RNA、特异的中性颗粒基质、某些胞浆蛋白等结合，主要是染细胞核的染料。还有一个很重要染核染料是苏木（hematoxyline），属媒染料（mordantdyes），需媒染剂（如Al3+）参与才能使细胞核着色。

2、酸性染料（aciddyes） 细胞学较重要的酸性染料有两大类，即荧烷一氧杂蒽染料（horane－xanthenedyes）和偶氮染料（azodyes）。前者是一类以氧杂蒽和醌式苯环作为发色基团，以羧基（－COOH）为助色基团的染料，因为羧基能提供一个质子，亦称“阴离子染料”。这类染料的代表是伊红Y（eosinY，俗称黄色伊红）和伊红B（eosinB，俗称蓝色伊红）。这两种染料特别适于与噻嗪类染料（亚甲蓝，天青B等）作对比染色，形成红蓝分明、色泽艳丽的结果，因为伊红具较强的扩散吸附染色特性。酸性偶氮类染料有橙黄G（orangeG）、刚果红（congored）、亮藏花精（brilliantcrocein）等。由于酸性染料是阴离子型染料，因此它们与细胞中的碱性成分结合并染色，如血红蛋白、嗜酸性颗粒成分及胞浆中的一些蛋白质。

除上述酸性和碱性染料外，有的还将在同一条件下既具阴离子型又有阳离子型的染色剂称复合染料，如瑞氏染色剂、姬姆萨染色剂等。

（二）染色原理

细胞着色的原理至今虽无满意的解释，但多数学者认为是物理作用和化学作用综合的结果。

1、物理作用

包括毛细管现象和渗透、吸收、吸附作用等。通过这些因素，染料的色素粒子就能顺利地进入组织、细胞并与其牢固结合而着色。

瑞氏染色法

Wrfeht和Giemsa都于1902年报告了各自的新的血液学染色剂，其主要特点是在制备多色性亚甲蓝（主要指天青B）方面做了改进，使血细胞和疟原虫着色较好，操作简便。

上述染色法均是含伊红和亚甲基蓝衍生物的复合染料。在临床检验工作中，瑞氏染色法常用于血液、其他体液、分泌物和排泄物涂片中各种细胞的染色，有利于在显微镜下观察细胞形态及对细胞进行分类检查。

【染色原理】

瑞氏染色分两相进行，第一相是酸性染料伊红与细胞中的碱性物质如血红蛋白、嗜酸性颗粒等结合；碱性染料天青B与细胞中的酸性物质如核染色质（chro－matin）、特异中性颗粒、血小板及富含核蛋白的胞质结合。第二相是天青B和伊红在适宜条件下形成紫色的天青B一伊红复合物（azureB－eosincomplex），这种复合物是形成Romanowsky－Giemsa效应的基础。

Romanowsky－Giemsa效应包括：①白细胞核染色质染成紫色，疟原虫的染色质染成红色；②中性粒细胞的颗粒及血小板颗粒区染成紫色；③产生本效应必须有两种染料参与，一种是天青B，另一种是伊红。

Wittekind（1985）指出，天青B与DNA分子中的磷酸基结合，而伊红既与DNA分子中的阳离子部位结合，又与天青B结合，与天青B的结合力来源于电子供一受体的电子转移力，天青B的甲氨基（－NHCHs）与伊红分子中的叛基（－COOH）间形成氢键。因此，天青B是噻嗪类染料中能与伊红形成复合物的最佳选择，因为拥有四个甲基侧链的亚甲蓝不能以氢键与伊红结合。

甲醇除作为染料的溶剂，能将瑞氏染料解离成带正电荷的天青B和带负电荷伊红外，因其具有脱水力，还可将细胞固定为一定形态，并使蛋白沉淀为颗粒状、网状结构，增加细胞与染料的接触表面，增强染色效果。

细胞中的各种有机物质（特别是蛋白质）、染料等对环境的州值非常敏感。如环境偏酸，氢离子增多，降低对碱性染料的亲和力；增强伊红着色，出现异常红染；相反，则可出现异常蓝染。最佳环境应维持在PH值64～6、8.因此，必须使用缓冲溶液。

【试剂】

1、Wright染液 瑞氏染粉0.1g；甲醇60.0ml.

将瑞氏染料放入清洁干燥乳钵里，加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料溶完，甲醇全部用完为止。或将瑞氏染粉和甲醇直接置于棕色瓶中，加碎玻璃适量，立即用力振荡smin，置室温中，连续3天，每天振摇2～3次，促其溶解。配好后放室温，一周后即可使用。新配染液效果差，放置时间越长天青B越多，染色效果越好。久置应密封，以免甲醇挥发或氧化成甲酸，甲醇需用AR级。上述量染液中也可加中性甘油3ml，除可防止染色中甲醇过早挥发外，并可使细胞着色清晰。

1、磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.4～6.8）

磷酸二氢钾（无水）0.3g；

磷酸氢二钠（无水）0.2g；

蒸馏水加至1000ml.

配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。

【染色方法】

（1）用蜡笔在血膜两头划线，然后将血片平放在染色架上；

（2）加瑞氏染液数滴，覆盖整个血膜，固定细胞约lmin；

（3）滴加等量或稍多的缓冲液，与染液充分混匀，染色5～10min；

（4）用清水冲去染液，待干后镜检。

【染色结果】在正常情况下，血膜外观染成淡紫红色。显微镜下，红细胞呈粉红色，在厚薄均匀处，略有碟状感；白细胞浆中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩。细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。

染色偏酸，则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红，白细胞核呈淡蓝色或不着色。染色偏碱，则所有细胞呈灰蓝色，颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色，甚至紫黑或蓝色。中性颗粒偏粗、偏碱，染成紫黑色，血膜厚的部位呈绿色。

【注意事项】

1、未干透血膜的不能立即染色，否则染色时易脱落。

2、染色时间，与染液浓度、室温及细胞多少有关。梁液淡、室温低、细胞多，则染色时间长；反之则可减少染色时间。染液浓淡及染色时间长短要摸索，特别是更换染液时更应如此。

3、染液不能过少，以防蒸发沉淀，一旦染液沉淀在血膜上，则不易冲掉。

4、冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防染料沉着在血膜上。冲洗染料时间不能过长，以防脱色。冲洗完的血片应立放于架上，防止剩余水分浸泡脱色。

5、如血膜上有染料颗粒沉积，可用甲醇溶解，但需立即用水冲掉甲醇，以免脱色。

6、染色过谈，可以复染，复架时应先加缓冲液，创造良好染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。

7、染色过深可用水冲洗或浸泡一定时间，也可用甲醇脱色。

8、染色偏酸或偏碱时，均应更换缓冲液再重染。