免疫浊度法

免疫浊度法本质上属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器、自动化检测系统和免疫沉淀反应相结合，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。

　　（一）免疫浊度法原理

 

 

　　当可溶性抗原与相应抗体在两者比例合适时，抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，如形成的复合物增加，反应液的浊度随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。

　　按照仪器设计的不同分为透射比浊仪测定法和散射比浊仪测定法。测定方法又可分为速率法和终点法。

　　1.免疫透射比浊法：

 

　　根据郎伯-比尔（Lambert-Beer）定律，当光线通过抗原抗体反应系统时，由于溶液中存在抗原抗体复合物，光线被吸收。吸收的量和复合物的量成正比。利用透射比浊仪测量出由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其浊度以吸光度A表示，A值反映了入射光与透射光的比率。

　　

 

 

　　C：溶液浓度

 

　　K：常数或cd

　　c：分子吸光系数

 

 

　　d：光路长

      2、免疫胶乳浊度测定法
　　在上述比浊法中，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。于是发展了免疫胶乳浊度测定，其基本原理是：将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比。
　　该技术的关键在于两个方面。首先是选择适用的胶乳，其大小（直径）要稍小于波长。用500nm波长者，选择100nm颗粒较适合；用585nm波长者，则选用100～200nm颗粒为好。目前多用200nm的胶乳颗粒。其次，胶乳与抗体结合时用化学交联虽好，但失活也较严重；一般用吸附法即可。

 

 

　　3.免疫速率散射比浊法：

 

　　其原理是指一定波长的光通过溶液遇到抗原抗体复合物时，光线被折射，发生偏转。偏转角度可以从0-90°，这种偏转的角度可因光线的波长和复合物大小不同而有所区别。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。同时也和散射夹角成正比，和波长呈反比。

 

　　测定方法有终点法和速率法两种。

 

　　终点法是在抗原-抗体反应达到平衡时，即复合物形成后作用一定时间，通常是30-60min，复合物浊度不再受时间的影响，但又必须在聚合产生絮状沉淀之前进行浊度测定。

　　速率法是在抗原抗体结合反应的过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率法是测最大反应的速度，即反应达到顶峰时的峰值。抗原抗体结合反应在几十秒内得出结果，峰值的高低与抗原的量成正比，峰值出现的时间和抗体浓度、抗原抗体的亲和力直接相关。速率法的灵敏度和特异性都比终点法好。

 

 

　　但是，必须指出的是对免疫浊度法存在难以克服的钩状效应。即在定量抗体中加入抗原量达到最佳比例时，形成的IC量最大，反应速度最快。如继续加入抗原，形成IC的量不但不再增加，反而减少；反之，在定量抗原中加入抗体，在抗体过量时也会产生同样的现象。这种后带（抗原过量）和前带（抗体过量），统称为钩状效应（hook effect）。钩状效应可以产生假象的弱阳性或假阴性结果。

　　（二）与免疫浊度法测定密切相关的因素有：

 

 

　　1.抗原与抗体的比例：理想状态是抗原与抗体比例合适全部结合，事实上有困难，根据Heidelberger曲线理论，反应液中保持抗体过量时，复合物随抗原量的增加递增至抗原与抗体两者比例最合适时达高峰，因此免疫浊度法中保持抗体过量；

　　2.抗体的质量：应是特异性强、效价高、亲和力强、并使用R型抗血清；

 

 

　　3.抗原抗体反应的溶液：关键是pH及离子种类，通常用磷酸盐缓冲液作反应液；

 

 

　　4.增浊剂的应用：通常用非离子型亲水剂，如聚乙二醇（PEG）、吐温-20等。