分子生物学技术在免疫检测中的应用

<center>  </center>

目前已有许多新生物学技术应用于免疫学研究，促进了免疫学的发展，丰富了免疫学检测的内容，使免疫学研究与相关疾病的诊断建立在基因水平，提高了检测的敏感性和可靠性。 �

 

一、分子杂交技术� 分子杂交的基本原理是根据双链DNA经高温解链成两条互补的单链，降温后又可恢复原来的双链。两条不同的单链分子可根据碱基配对的原则，只要它们的碱基序列同源或部分同源，即可全部或部分复性，此称核酸杂交。用来探测DNA的已知互补片段称为DNA探针，通常是应用已预先经放射性标记或非放射性标记的DNA单链来识别另一核酸分子中与其同源的部分，其特异性和敏感性极高。实验方法有印迹杂交(southern blot)、斑点杂交和原位杂交。目前分子杂交技术已应用于免疫球蛋白分子、T细胞受体、补体、细胞因子以及MHC分子的基因结构、功能及表达等方面的研究。�

二、转基因技术�

转基因技术是近年来生物技术中的一项重大突破。其建立使得动物可不必通过有性杂交即能获得新的基因。其基本原理是通过显微注射或逆转录病毒，将外源性基因导入哺乳动物的受精卵或其早期胚胎，并经分子杂交分析胚胎或其后代组织中是否有外源性基因存在及其在体内的表达情况。目前通过转基因技术建立的转基因鼠，已应用于研究多种免疫分子的基因表达、自身反应性T细胞的负选择作用及自身耐受机制、MHC的表达与糖尿病的关系等。此外也可将分离的目的基因与载体(质粒或噬菌体)通过粘性末端结合后，转移至原核或真核细胞，使其整合到宿主细胞DNA上，藉以生产重组细胞因子等，为进一步研究免疫分子的结构与功能及临床疾病的诊断提供理想的制剂。�

 

 

三、多聚酶链反应�

多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)又称体外核酸扩增技术，即对特定DNA片段进行非细胞依赖性扩增，其基本过程是将已提取的待测DNA在一对寡核苷酸引物、三磷酸核苷及耐热DNA多聚酶存在的情况下，分别于90℃、55℃和72℃下经变性、退火和核苷酸链的延伸，如此循环数十次||以扩增DNA。扩增物经溴乙锭染色后作凝胶电泳，再于紫外灯下观察特定碱基对数的DNA片段，以出现橙红色的电泳带为阳性。若需进一步鉴定，可将凝胶分离的DNA回收再用特异性探针进行杂交分析。�

PCR在免疫学中通常应用于癌基因、凋亡相关基因的表达、HLA的定型与基因分析、免疫球蛋白和T细胞受体多样性研究以及细胞因子、粘附分子的检测。PCR的方法有30余种，如多重PCR、巢式PCR、二次PCR、共享引物PCR、逆转录PCR、锚定PCR等等。现临床研究最常用的是逆转录PCR，现简介如下：首先提取细胞总RNA，然后在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板合成cDNA，随后加入特异性引物进行扩增，再经琼脂糖电泳检测特异性的DNA，从而反映出某种基因的转录状况。