微生物学检验基本技术(2)

第六节 自动化技术在微生物检验中的应用

　　微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。数码分类技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。本节简要介绍有关情况。

一、微生物数码鉴定法
　　早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和形成独特的不同细菌鉴定系统。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。

( 一)数码鉴定法基本原理
数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着电脑技术的进步，这一过程已变得非常容易。

1．简要介绍计算步骤：
(1)出现频率（概率）的计算：将记录成阳性或阴性结果转换成出现频率：①对阳性特征，则除以100即得。②对阴性特征，除以100的商被1减去即可。③说明：对“0”和“100”，因这2个数太超量，为了使结果不出现过小或过大，而用相似值0.01或0.99值代替。
(2)在每一个分类单位中，将所有测定项目的出现频率相乘，得出总出现频率。
(3)在每个分类菌群中的所有菌的总出现频率相加，除以一个分类单位的总出现频率，乘100，即得鉴定%（%id）
(4)在每个菌群中，再按%id值大小顺序重新排列。将未知菌单次总发生频率除以最典型反应模式单次总发生频率，得到模式频率T值，代表个体与总体的近似值。T值越接近1，个体与总体越接近，鉴定价值越大。按%id大小排序，将相邻两项的%id之比为R，代表着首选条目与次选条目的差距，差距越大，价值越大。如果%id≥80，参考T及R值可作出鉴定。

2．在编码检索本中检索数据谱得出的结果有以下几种形式（以API鉴定系统为例）。
(1)有此数码谱:①有一个或几个菌名条目及相应的鉴定值（%id和T值）。②对鉴定结果好坏的评价，最佳……等。③用小括号列出关键的生化结果及阳性百分率。④有时，鉴定结果不佳或有多条菌名条目,需进一步补充试验项目才能得出良好的鉴定结果。⑤指出某些注意要点，需用“推测性鉴定”，并将此菌送至参考实验室；需用“血清学鉴定”，作进一步的证实等。
(2)无此数码谱：可能有以下原因：①此生化谱太不典型。②不能接受，鉴定值低(%id＜80.0)。③可疑。需进一步确认是否纯培养，重新鉴定，可与供应商技术服务部联系。

3. 结果解释
(1)如果排序第一的细菌%id≥80.0，则可将未知菌鉴定在此条目中，并按%id值的大小对鉴定的可信度作出评价。%id≥99.9和T≥0.75为最佳的鉴定；%id 99.0~98.9之间，T≥0.5为很好的鉴定；%id 90.0~98.9之间，T≥0.25为好的鉴定；%id 80.0~89.9之间为可接受的鉴定。
(2)如果第一条目的%id＜80.0，则将前2个条目的%id加在一起，若仍不足80.0，则将前3个%id相加。若≥80.0，则有2种可能：①为同种细菌，可能是不同生物型。②为同一菌属的不同种。
如果相加的几个条目既不属于同一细菌种，又不属于同一细菌属，在评价中会指出“补充生化反应”的项目及阳性反应率，可通过这些生化反应将几种菌区分开来。若前3个条目的和＜80.0，则为不可接受的结果。
(二)数码鉴定在临床上的应用
国内外已有许多种用于临床细菌鉴定的数码鉴定系统，为临床微生物学实验室对细菌的鉴定提供了简便、快速的方法。目前常见微生物鉴定系统见表6-4-3
表6-4-3 目前常见微生物鉴定系统

生产厂商 系统名称 可鉴定的微生物 孵育时间及条件
ANI 厌氧菌 ４h；需氧
API20A 厌氧菌 2４h；厌氧
API An-IDENT 厌氧菌 ４h；需氧
API Staph（STAPH－Trac） 葡萄球菌、微球菌 2４h
GPI 革兰阳性球菌和杆菌 2~15h
ID32 Staph 葡萄球菌 24h
API Coryne(Rapid CORYNE) 棒状杆菌及相关菌 24h
API 20Strep(Rapid STREP) 链球菌、肠球菌 ４~24h
API 20E 肠杆菌科、非发酵菌 2４~48h
EPS (Enteric Pathogen Screen） 爱德华菌属、沙门菌属、志贺菌属、耶尔森菌属 ４~8h
GNI 肠杆菌科、非发酵菌 2~18h
GNI＋ 肠杆菌科、非发酵菌 2~12h
UID／UID-3 尿液来源尿道致病菌 1~13h
YBC 酵母菌 24~48h
API 20C AUX 酵母菌 48~72h

Crystal Anaerobe 厌氧菌 ４h
Crystal E/NF 肠杆菌科、某些革兰阴性非发酵菌 18~2４h
Crystal Gram Positive 革兰阳性球菌和杆菌 18~2４h
Crystal MRSA ID MRSA ４h
Crystal Neisserial/Haemophilus 奈瑟菌属、嗜血杆菌属、莫拉菌属、加德纳菌属、其它的苛养菌 ４h
Crystal Rapid Gram Positive 革兰阳性球菌和杆菌 ４h

Crystal Rapid stool/Enteric 革兰阴性肠道致病菌 ３h
Enterotube Ⅱ 肠杆菌科 18~24h
ID Tri-Panel 革兰阴性和阳性菌 16~20h；40~44h
MiniTek 厌氧菌、肠杆菌科、革兰阳性菌、奈瑟菌属、非发酵菌、酵母菌 4h（肠杆菌科、奈瑟菌属）
72h（酵母菌）

Oxi／FermⅡ 革兰阴性、氧化酶阳性葡萄糖发酵或不发酵菌
24~48h
NEG ID Type2 肠杆菌科、其它的发酵和非发酵菌 15~42h
Pos ID 革兰阳性球菌和李斯特菌属 18~48h
Rapid Anaerobe 厌氧菌 4h；需氧
Rapid HNID 奈瑟菌属、嗜血杆菌属、卡他莫拉菌、阴道加德纳菌 4h
Rapid NEG ID Type2 肠杆菌科、其他的发酵和非发酵菌 2h
Rapid NEG ID Type3 肠杆菌科、其他的发酵和非发酵菌 2.５h
Rapid Pos ID 革兰阳性球菌和李斯特菌属 2h
Rapid Yeast ID 酵母菌 4h

Micro-ID 肠杆菌科 4h
RapID ANAⅡ 厌氧菌 4~6h；需氧
RapID CB Plus 棒状杆菌 4h
RapID NF Plus 非发酵革兰阴性杆菌 4h
RapID NH 奈瑟菌、嗜血杆菌和其它革兰阴性细菌 4h；1h(淋球菌)
RapID onE 肠杆菌科和其它氧化酶阴性菌 4h
RapID STR 链球菌 4h
RapID Yeast Plus 酵母菌和酵母菌样菌 4h

AN 厌氧菌 4~16h；需氧
GN Microplate 需氧革兰阴性杆菌 4~24h
GP Microplate 大多数革兰阳性球菌和杆菌 4~24h
YT 酵母菌 24~72h
Neisseria Enzyme test 奈瑟菌属、莫拉菌属 30min
r/b Enteric Differential System 肠杆菌科 18~24h
Uni-Yeast Tek 酵母菌 24h~6d
Uni-N/F-Tek 革兰阴性发酵或不发酵细菌 24~28h
Medical Specialties Inc. Fox Exera GNI 肠道和非肠道革兰阴性杆菌 18~24h
AccuMed International, Inc. Sensititre AP 80 肠杆菌科和非发酵革兰阴性杆菌 5~18h

二、自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统
　　自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统在临床微生物实验室的应用，为微生物检验工作者对病原菌的快速诊断和药敏试验提供了有力工具。鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。各种微生物鉴定系统的反应基础见表6-4-4。
药敏试验分析系统的基本原理是将抗生素微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育，通过测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。在含有抗生素的培养基中，浊度的增加提示细菌生长，根据判断标准解释敏感或耐药。

表 6-4-4 各种微生物鉴定系统的反应基础

系统源性 需要培养 分析 阳性结果指示 系统举例
酶谱分析
(通常2~4h) 不需要 酶活性 色原性／荧光性底物混合物被酶水解后产生颜色变化 MicroScan Rapid panels、IDS
pH为基础的反应
（通常15~24h） 需要 碳水化合物利用 pH指示颜色变化 碳水化合物分解产酸，蛋白质或含氮化合物被水解产碱 API、Crystal、VITEK cards、 Micro Scan conventional panels
碳源利用 需要 有机物 无色变为紫色 Biolog
挥发性和不挥发酸测定 需要 细胞脂肪酸 气相色谱鉴定终末产物与已知图谱比较 MIDI
肉眼观察生长 需要 各种底物 混浊生长 酵母菌鉴定

半自动化细菌鉴定和/或药敏分析系统
1．VITEK-ATB半自动细菌鉴定和药敏分析系统
VITEK-ATB是生物-梅里埃公司产品，由计算机和读数器两部分组成，计算机程序包括ATB和API的鉴定数据库、ATB的药敏数据库、数据储存和分析系统及药敏专家系统。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机读取结果，由计算机进行分析和处理，并报告细菌鉴定和药敏结果。

2．AutoScan-4半自动细菌鉴定和药敏分析系统
AutoScan-4是由Dade MicroScan公司生产，由计算机和读数器两部分组成。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机，自动判读鉴定和药敏试验结果；亦可人工进行判读，将编码输入计算机，由计算机软件评定结果。有鉴定及鉴定药敏复合板两种测试卡。

3．BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统
BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统是BD公司产品，将传统的酶、底物生化呈色反应与先进的荧光增强显色技术结合以设计鉴定反应最佳组合。反应板在机外孵育后，上机自动判读鉴定结果。配套提供独立分装的鉴定用肉汤试管，确保无菌状态，使用方便。配套比浊仪可快速调配所需浊度的菌液

4．AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统
AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统是Trek Diagnostic Systems LTD.产品，由计算机和读数仪等组成。采用荧光测定法，反应板在机外作定时孵育后，上机读数，由SAMS软件评定测定结果，也可通过SAMS系统人工确认法输入计算，或完全由人工输入作评定。所用鉴定板和药敏板与全自动机型中的反应板是一样的。

5．抑菌圈直径测量仪
抑菌圈直径测量仪有BIOMIC（Giles Scientific Inc），AccuZone System (AccuMed International Inc) ，SIRSCAN (SIRSCAN) 等三种单板读取机，已在临床应用。经孵育后的药敏平板，被仪器的图象分析系统识别并计算抑菌圈直径。根据判断标准，报告药敏试验结果。这些仪器可减少人工测量抑菌圈直径大小差异及主观判断错误。BIOMIC系统宣称能根据抑菌圈大小来计算MIC，值得注意的是该类仪器对抑菌圈内模糊生长或微小的菌落不能正确识别，而这些菌落对细菌的耐药性的判定至关重要，读取每个平板时必须进行人工观察。

（二）全自动的微生物鉴定和药敏试验分析系统
1．VITEK 系统
VITEK AMS是由生物-梅里埃公司生产的全自动微生物鉴定和药敏分析系统。第一代产品有以下四个规格VITEK AMS 32、60、120、240。由计算机主机、孵育箱/读取器、充填机/封口机、打印机等组成。鉴定原理是根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果。在每张卡上有30项生化反应。由计算机控制的读数器，每隔1h对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值，并自动打印出实验报告。
获得细菌的纯培养后，调整菌悬液浓度，根据不同的细菌选择相应的药敏试验卡片，在充液仓中对卡片进行充液。置孵育箱／读数器中孵育，自动定时测试、读取数据和判断结果。VITEK可快速鉴定包括各种肠杆菌科细菌、非发酵细菌、苛氧菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌和酵母菌等500种临床病原菌。具有20多种药敏测试卡、97种抗生素和测定超广谱β-内酰胺酶测试卡，快速检测细菌药敏情况。
该系统有根据细菌耐药规律而设定的专家系统，可帮助校正和修改结果。对于专家系统提示的不可能的或极少见的耐药表型应予以充分重视，需采用确认试验重新鉴定。如对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌，对泰能耐药的肠杆菌，对青霉素耐药的β溶血性链球菌等。
VITEK-2是生物-梅里埃公司开发的新一代微生物分析仪，其工作原理与VITEK AMS没有大的差别，但它的容量更大，自动化程度更高，并且使用64孔的反应卡片，鉴定更准确可靠，可同时测定20种抗生素的药敏试验。

2. MicroScan Walk/ Away系统
MicroScan Walk/ Away系统由主机、真空加样器、孵育箱/读取器、计算机、打印机等组成。除采用传统呈色反应法外，同时采用敏感度极高的快速荧光测定技术来检测细菌胞外酶，鉴定板有普通板和快速板两种，普通板获得结果需要16~18h，快速板测定只需2~3.5h。该系统有8种鉴定反应板，可鉴定包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、酵母菌、嗜血杆菌和奈瑟菌等近800种细菌。药敏部分采用比浊法进行测定，90％菌株可在5.5h内获得对17~33种抗菌药物的MIC值。此系统有walk / Away－40和96两个型号，40或96分别代表该系统可同时容纳40或96个测试板。

3．PHOENIXTM 系统
PHOENIXTM System是新一代全自动快速细菌鉴定/药敏系统，由BD公司生产。鉴定试验采用BD专利荧光增强技术与传统酶、底物生化呈色反应相结合的原理。药敏试验采用传统比浊法和BD专利呈色（Chromogenic）反应双重标准进行药敏试验结果判断。仪器由主机、比浊仪、微生物专家系统等组成。有PHOENIXTM 100或50 二种型号。PHOENIXTM 100型分别可进行100个鉴定试验和100个药敏试验。可鉴定革兰氏阳性菌139种、革兰氏阴性菌158种。有鉴定板、药敏板或鉴定/药敏复合板3种可供选择。每个鉴定药敏复合板有51孔用于鉴定试验，85孔用于药敏试验，可同时进行17种抗菌素5种浓度或28种抗菌素3种浓度的MIC药敏试验。90%细菌的鉴定在3~6h完成，鉴定准确率大于90%，85%的细菌药敏试验在4~6h内出结果。

4．SENSITITRE　ARIS系统
该系统由计算机主机、孵育箱/读数仪、全自动加样器等组成。在培养箱中设置可存放64块板的转盘，每块板均能检测3个标本，故同时可检测192个菌种标本。在测定板底物中加入酶基质，使其与细菌产生的酶结合成荧光物质。在较短时间内能够分析不同生化底物所反映出的荧光物质，通过荧光读数仪检测板孔中荧光Biocide和Willcox值来鉴定细菌。该系统的药敏试验有两种测定法，即当采用人工判定时为比浊法，当采用仪器自动判读时为荧光测定法。但均参照NCCLS的标准和规则来解释结果。大多数菌种均可在5小时内报告检验结果。通常有革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、苛氧菌及真菌鉴定板和300多种抗菌药物不同组合的药敏板及鉴定/药敏复合板。

(三)使用自动化鉴定仪的局限性
1．自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。目前为止，尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定资料。对细菌的分类是根据传统的分类方法，因此鉴定也以传统的手工鉴定方法为“金标准”。使用自动化鉴定仪的实验室，应对技术人员进行手工鉴定基础与操作技能培训。
2．细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变，使用自动化鉴定仪的实验室应经常与生产厂家联系，及时更新数据库。实验室技术人员应了解细菌分类的最新变化，便于在系统更新之前即可进行手工修改。
3．通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。

三、自动化的血液细菌培养系统
　　正常血液是无菌的，细菌侵入可导致菌血症、败血症、脓毒血症，及时准确地进行病原学诊断极为重要。传统的血培养是抽取5ml血液注入血培养瓶中，放入孵箱，每天观察结果，费时费力，不能及时发阳性结果，易延误诊断。
全自动血液细菌培养仪主要优点是可以在较短培养时间内提示出血液培养瓶中有无微生物的存在。

1．BACTEC系列
BACTEC460、NR-730是早期的血液培养仪，目前基本上已被BACTEC9000系列替代（包括9050、9120和9240三种型号，可分别容纳50、120和240个培养瓶）。微生物在生长过程中消耗培养基内的营养物质，产生的二氧化碳直接激活瓶底部预埋的对二氧化碳浓度变化高度敏感的荧光物质，在激发光的激发下放出荧光，荧光的强度变化直接反映瓶内二氧化碳浓度变化，来判断瓶内有无微生物生长。根据不同的培养要求，该系统配置了标准需氧／厌氧培养瓶、有中和抗菌药物的树脂培养瓶、厌氧菌和真菌等多种培养瓶。细菌培养生长曲线、结果等均可在联机的计算机上显示出来。

2．BacT／Alert系统
该系统有BacT／Alert48、72、96、120、240及3D等型号。主要测定原理为当培养瓶内有微生物生长，代谢过程中产生的二氧化碳可经过半透膜渗透至瓶底，与固定于瓶底的Novel／CO2感应器结合，产生颜色变化，通过光电检测得知二氧化碳变化情况。通过计算机处理后，在曲线图上反映、分析、判断阴性或阳性结果，并及时报警。该系统可在任何时间内放入培养瓶，通过条码识别允许该标本进入系统，并连续跟踪监测。系统配置有需氧培养瓶、厌氧培养瓶、中和抗生素需氧瓶、中和抗生素厌氧瓶、小儿培养瓶、血液分枝杆菌培养瓶和痰液分枝杆菌培养瓶等。

3. VITAL系统
主要测定原理为使用均质荧光技术的快速培养系统，培养瓶内的液体培养基中含有荧光底物，当细菌生长后，产生的质子、电子和离子与荧光分子结合后，使荧光物变成无荧光化合物，通过测量每瓶内荧光强度来反映细菌生长情况。

4．ESP血培养系统
主要测定原理为细菌在生长过程中消耗氧，产生氮气、氢气和二氧化碳，导致培养瓶内压力改变。该系统采用气压传感技术，通过压力传感器监测瓶内压力变化，报警提示有细菌生长。

四、结核分枝杆菌快速检测系统
结核分枝杆菌的经典培养是将标本接种在特定培养基上，定时观察，15天后生长的为可疑菌落。判定阴性需8周时间，要完成阳性病例的鉴定、药物敏感试验需2~3个月，且阳性率低，不易标准化。二十世纪七十年代以来，采用14C棕榈酸作为底物快速检测结核分枝杆菌，使快速分离及鉴定结核分枝杆菌成为可能。第一代的仪器为BD公司的BACTEC 460TMTB培养仪，由于14C的放射性环境污染及探针穿刺开放等缺陷，基本上已被淘汰。BACTEC 9000系列为了克服放射性的缺陷，改用荧光增强技术。由于分枝杆菌的生长需要添加一定浓度的二氧化碳，因此检测培养瓶中氧浓度的变化比二氧化碳浓度的变化更加敏感直接。BACTEC 9000系列利用对氧浓度敏感的荧光物质，来测定培养瓶中结核分枝杆菌的生长。BACTECTMMYCO／FTIC（含溶血素分枝杆菌／真菌培养瓶）适用于血液及无菌体液中结核分枝杆菌和真菌的检测。由于添加了溶血素，破坏了红细胞等血细胞对氧的利用，避免了假阳性。BACTECTMMYCO／FSPuta培养适用于其它污染标本的使用。在此二种瓶中有阳性生长时，需鉴别是结核分枝杆菌还是真菌及其它细菌生长所引起的阳性，它们仅适用于结核分枝杆菌的筛查。

BACTEC960和BacT／ALERT3D系统，可进行结核分枝杆菌的初代培养、阳性结果的鉴定和药敏试验。通过对标本的消化处理后，接种分枝杆菌快速培养管。培养管的基本组成为：①改良Middle Brook 7H9分枝杆菌专用增菌肉汤。②抗菌剂 两性霉素B，阿洛西林，奈啶酸，多粘菌素B，甲氧嘧啶，万古霉素。③营养添加剂。平均阳性检出时间为9~13d，鉴定4~5d。大大加快了结核分枝杆菌的检出。

还有一些适用于小型实验室的手工结核分枝杆菌快速鉴定系统。包括标本前处理管、结核分枝杆菌快速生长管、鉴定试验管、药敏试验管及荧光判读器。

3．16S rRNA同源性分析
(1) rRNA-DNA杂交：变性rRNA与变性DNA混合时，rRNA与其互补的DNA链形成杂交双链，rRNA分子与异源DNA杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交双链的稳定性与其同源性成正相关，适于细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是硝酸纤维膜结合法。
(2)16S rRNA序列测定：rRNA分子具有高度保守性，在所有的细胞生物中都存在，在长期的进化中，16S rRNA的总碱基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互对齐进行比较。1985年Lane等提出了改良的Sanger双脱氧链终止法测定rRNA序列，以rRNA为模板，以一个或多个寡核苷酸链做引物（与rRNA分子上的一段保守区域互补的15~20个核苷酸），用反转录酶合成反转录DNA。随着PCR技术的成熟，出现了利用PCR技术扩增16S rRNA基因（rDNA），然后采用Sanger法分析rDNA序列的方法，该法比前者更方便。当前的细菌分类要求测定16S rRNA基因的全序列来进行比较。16S rRNA基因序列分析技术是建立系统分类的主要技术，有人建议DNA相关性≥70%，16S rRNA序列差异≤1%~1.5%的细菌属于同一种，这使细菌的种有一个稳定和统一的标准。

二、分子生物学技术在细菌鉴定中的应用
十九世纪，细菌的鉴定主要依靠细菌的表型特征，因耗时长，往往耽误了对疾病诊断与治疗。随着分子生物学技术的发展及在临床微生物学检验中的应用，为微生物学实验室对细菌的快速鉴定，尤其是对难分离细菌的快速鉴定，提供了有利条件。目前在细菌鉴定中应用的分子生物学技术主要有核酸探针和核酸扩增技术等。

1．核酸探针技术
应用核酸探针技术检测病原微生物核酸是临床诊断学的重大发展，其原理是用带有酶、化学荧光物、放射性核素或生物素标记的已知序列特定DNA片段（称为探针），在一定条件下，按碱基互补原则探针与待测标本中的核酸杂交，通过对杂交信号的检测，从而鉴定标本中有无相应的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探针技术有固相杂交（斑点杂交、原位杂交、Southern印迹、Northern印迹等。）和液相杂交技术。
核酸探针适用于直接检出临床标本中的病原微生物，不受非病原微生物的影响，因此对某些尚不能分离培养或很难分离培养的微生物的检测具有重要的意义。随着探针标记的不断改进，检测试剂盒商品化，操作更简便易行。

核酸扩增技术
核酸扩增（又称基因或DNA扩增）技术是体外酶促合成DNA片段的新方法，其原理类似于DNA的体内半保留复制。主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成。即在高温下（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37~55℃）情况下，两条人式合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物的3`端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5` 3`方向延伸，合成DNA新链。这样每一双链DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使人工合成的引物间的DNA特异区段拷贝数扩增一倍。经过上述25~40个循环后，靶序列可以扩增成106~108。

核酸扩增技术（或称聚合酶链反应技术，PCR）具有高敏感性、高特异性、简便、快速等特点，临床实验室常用PCR技术来检测标本中某些微生物，尤其是对难以培养微生物的检测。其它用于检测微生物的PCR技术还有：RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和随机引物PCR等。核酸扩增技术在临床微生物学检验中的应用见表6-4-2。

表6-4-2 核酸扩增技术在临床微生物学检验中的应用

微生物种类 核酸扩增技术 应 用
金黄色葡萄球菌 多重PCR 对mecA基因检测
凝固酶阴性葡萄球菌 多重PCR 对mecA基因检测
肺炎链球菌 PCR 自溶酶和青霉素结合酶的检测
化脓性链球菌 PCR M蛋白基因的菌株分型

淋病奈瑟菌 LCR 尿道分泌物标本直接检测
百日咳杆菌 PCR、巢式PCR 临床标本检测
结核分枝杆菌
PCR、SDA、Qbeta 肺结核的诊断、呼吸道标本检测、临床标本直接检测
鸟分枝杆菌复合群 PCR 鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的区别
白喉棒状杆菌 PCR 产毒菌株的检测
肠致病性大肠埃希菌 多重PCR 产毒菌株检测
伤寒、副伤寒沙门菌 PCR 耐药质粒分型和检测
幽门螺杆菌 多重PCR 胃活检组织细菌检测
小肠结肠炎耶尔森菌 PCR 菌株分型
弯曲菌属 PCR 通过16s rRNA鉴定
杜克雷嗜血杆菌 多重PCR 生殖道溃疡病人的直接检测
嗜肺军团菌 PCR 与爆发相关菌株的分型
金氏杆菌属 PCR 临床标本鉴定
念珠菌属 PCR 通过“DNA”指纹鉴定
梅毒螺旋体 多重PCR 生殖道溃疡标本直接检测
伯氏螺旋体 巢式PCR 治疗前、中、后检测
问号状钩端螺旋体 PCR 钩端螺旋体血清型的鉴定
CDC group Ⅳ 群 PCR 分型
沙眼衣原体 PCR 无症状病人的诊断
三、分子生物学技术在细菌药敏试验中的应用
分子生物学技术在检测耐药基因方面日益受到重视。临床上可用PCR方法检测耐药基因，来判断待检菌对某种抗菌药物是否具有耐药性。但某些沉默耐药基因，如不表达相应产物，则可能不表现耐药表型。现在已有检测耐药基因的DNA探针和PCR商品化试剂盒供应，但多用于实验研究，常规工作中开展较少。目前能检测的耐药基因有：
β-内酰胺类
mecA、blaTEM、blaROB-1、blaSHV、blaIMP、blaMIR-1、blaOXA、blaPER-1、blaPER-2、blaOXY-1、blaOXA-10/11。
氨基糖苷类
aph（3’）—Ⅲ、aph（3’）—Ⅵ、ant（2〃）Ia、ant（4’）-Ia、aac（3） -Ia、acc（6’）-Ia、aac（3）-Va、aac（6’）-aph（2〃）、ant（4’）、ant（6’）-Ia、aac（6’）-Ic、aac（3）-Ib、aad（2〃）-Ia、ant（6）-I、aph（2〃）-Ic。
氯霉素
catP、catQ、catD、catI
环内酯类
ereA、ereB、ermA、ermAM、ermC、ermF、smp、mphA、mefA、vat。
磺胺类
sulⅠ、sulⅡ,sulA。
四环素
tet（A）、tet（C）、tet（D）、tet（K）、tet（L）、tet（M）、tet（O）、tet（P）、tet（S）、tet（Q）、tet（U）、tetA（P）。
甲氧苄啶
dhfrⅠ、dhfrⅡ、dhfrⅢ、dhfrⅤ、dhfrⅦ、dhfrⅨ、dhfrⅩ、dfrA、folH、dhfrⅧ。
8．糖肽类
vanA、vanB、vanB2, vanC1、vanC3、vanD。
9．喹诺酮类
gyrA、gyrB、parE。
10．乙胺丁醇
embB。
11．吡嗪酰胺
pncA。
12．利福平
rpoB。
13．链霉素
rpsL、rrs。
14．异烟肼
katG、inhA、ahpC。

第六节 自动化技术在微生物检验中的应用

微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。数码分类技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。本节简要介绍有关情况。

一、微生物数码鉴定法
早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和形成独特的不同细菌鉴定系统。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。

( 一)数码鉴定法基本原理
数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着电脑技术的进步，这一过程已变得非常容易。
1．简要介绍计算步骤：
(1)出现频率（概率）的计算：将记录成阳性或阴性结果转换成出现频率：①对阳性特征，则除以100即得。②对阴性特征，除以100的商被1减去即可。③说明：对“0”和“100”，因这2个数太超量，为了使结果不出现过小或过大，而用相似值0.01或0.99值代替。
(2)在每一个分类单位中，将所有测定项目的出现频率相乘，得出总出现频率。
(3)在每个分类菌群中的所有菌的总出现频率相加，除以一个分类单位的总出现频率，乘100，即得鉴定%（%id）
(4)在每个菌群中，再按%id值大小顺序重新排列。将未知菌单次总发生频率除以最典型反应模式单次总发生频率，得到模式频率T值，代表个体与总体的近似值。T值越接近1，个体与总体越接近，鉴定价值越大。按%id大小排序，将相邻两项的%id之比为R，代表着首选条目与次选条目的差距，差距越大，价值越大。如果%id≥80，参考T及R值可作出鉴定。

2．在编码检索本中检索数据谱得出的结果有以下几种形式（以API鉴定系统为例）。
(1)有此数码谱:①有一个或几个菌名条目及相应的鉴定值（%id和T值）。②对鉴定结果好坏的评价，最佳……等。③用小括号列出关键的生化结果及阳性百分率。④有时，鉴定结果不佳或有多条菌名条目,需进一步补充试验项目才能得出良好的鉴定结果。⑤指出某些注意要点，需用“推测性鉴定”，并将此菌送至参考实验室；需用“血清学鉴定”，作进一步的证实等。
(2)无此数码谱：可能有以下原因：①此生化谱太不典型。②不能接受，鉴定值低(%id＜80.0)。③可疑。需进一步确认是否纯培养，重新鉴定，可与供应商技术服务部联系。

3. 结果解释
(1)如果排序第一的细菌%id≥80.0，则可将未知菌鉴定在此条目中，并按%id值的大小对鉴定的可信度作出评价。%id≥99.9和T≥0.75为最佳的鉴定；%id 99.0~98.9之间，T≥0.5为很好的鉴定；%id 90.0~98.9之间，T≥0.25为好的鉴定；%id 80.0~89.9之间为可接受的鉴定。
(2)如果第一条目的%id＜80.0，则将前2个条目的%id加在一起，若仍不足80.0，则将前3个%id相加。若≥80.0，则有2种可能：①为同种细菌，可能是不同生物型。②为同一菌属的不同种。
如果相加的几个条目既不属于同一细菌种，又不属于同一细菌属，在评价中会指出“补充生化反应”的项目及阳性反应率，可通过这些生化反应将几种菌区分开来。若前3个条目的和＜80.0，则为不可接受的结果。
(二)数码鉴定在临床上的应用
国内外已有许多种用于临床细菌鉴定的数码鉴定系统，为临床微生物学实验室对细菌的鉴定提供了简便、快速的方法。目前常见微生物鉴定系统见表6-4-3
表6-4-3 目前常见微生物鉴定系统

生产厂商 系统名称 可鉴定的微生物 孵育时间及条件
ANI 厌氧菌 ４h；需氧
API20A 厌氧菌 2４h；厌氧
API An-IDENT 厌氧菌 ４h；需氧
API Staph（STAPH－Trac） 葡萄球菌、微球菌 2４h
GPI 革兰阳性球菌和杆菌 2~15h
ID32 Staph 葡萄球菌 24h
API Coryne(Rapid CORYNE) 棒状杆菌及相关菌 24h
API 20Strep(Rapid STREP) 链球菌、肠球菌 ４~24h
API 20E 肠杆菌科、非发酵菌 2４~48h
EPS (Enteric Pathogen Screen） 爱德华菌属、沙门菌属、志贺菌属、耶尔森菌属 ４~8h
GNI 肠杆菌科、非发酵菌 2~18h
GNI＋ 肠杆菌科、非发酵菌 2~12h
UID／UID-3 尿液来源尿道致病菌 1~13h
YBC 酵母菌 24~48h
API 20C AUX 酵母菌 48~72h

Crystal Anaerobe 厌氧菌 ４h
Crystal E/NF 肠杆菌科、某些革兰阴性非发酵菌 18~2４h
Crystal Gram Positive 革兰阳性球菌和杆菌 18~2４h
Crystal MRSA ID MRSA ４h
Crystal Neisserial/Haemophilus 奈瑟菌属、嗜血杆菌属、莫拉菌属、加德纳菌属、其它的苛养菌 ４h
Crystal Rapid Gram Positive 革兰阳性球菌和杆菌 ４h

Crystal Rapid stool/Enteric 革兰阴性肠道致病菌 ３h
Enterotube Ⅱ 肠杆菌科 18~24h
ID Tri-Panel 革兰阴性和阳性菌 16~20h；40~44h
MiniTek 厌氧菌、肠杆菌科、革兰阳性菌、奈瑟菌属、非发酵菌、酵母菌 4h（肠杆菌科、奈瑟菌属）
72h（酵母菌）

Oxi／FermⅡ 革兰阴性、氧化酶阳性葡萄糖发酵或不发酵菌
24~48h
NEG ID Type2 肠杆菌科、其它的发酵和非发酵菌 15~42h
Pos ID 革兰阳性球菌和李斯特菌属 18~48h
Rapid Anaerobe 厌氧菌 4h；需氧
Rapid HNID 奈瑟菌属、嗜血杆菌属、卡他莫拉菌、阴道加德纳菌 4h
Rapid NEG ID Type2 肠杆菌科、其他的发酵和非发酵菌 2h
Rapid NEG ID Type3 肠杆菌科、其他的发酵和非发酵菌 2.５h
Rapid Pos ID 革兰阳性球菌和李斯特菌属 2h
Rapid Yeast ID 酵母菌 4h

Micro-ID 肠杆菌科 4h
RapID ANAⅡ 厌氧菌 4~6h；需氧
RapID CB Plus 棒状杆菌 4h
RapID NF Plus 非发酵革兰阴性杆菌 4h
RapID NH 奈瑟菌、嗜血杆菌和其它革兰阴性细菌 4h；1h(淋球菌)
RapID onE 肠杆菌科和其它氧化酶阴性菌 4h
RapID STR 链球菌 4h
RapID Yeast Plus 酵母菌和酵母菌样菌 4h

AN 厌氧菌 4~16h；需氧
GN Microplate 需氧革兰阴性杆菌 4~24h
GP Microplate 大多数革兰阳性球菌和杆菌 4~24h
YT 酵母菌 24~72h
Neisseria Enzyme test 奈瑟菌属、莫拉菌属 30min
r/b Enteric Differential System 肠杆菌科 18~24h
Uni-Yeast Tek 酵母菌 24h~6d
Uni-N/F-Tek 革兰阴性发酵或不发酵细菌 24~28h
Medical Specialties Inc. Fox Exera GNI 肠道和非肠道革兰阴性杆菌 18~24h
AccuMed International, Inc. Sensititre AP 80 肠杆菌科和非发酵革兰阴性杆菌 5~18h

二、自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统
自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统在临床微生物实验室的应用，为微生物检验工作者对病原菌的快速诊断和药敏试验提供了有力工具。鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。各种微生物鉴定系统的反应基础见表6-4-4。
药敏试验分析系统的基本原理是将抗生素微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育，通过测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。在含有抗生素的培养基中，浊度的增加提示细菌生长，根据判断标准解释敏感或耐药。

表 6-4-4 各种微生物鉴定系统的反应基础

系统源性 需要培养 分析 阳性结果指示 系统举例
酶谱分析
(通常2~4h) 不需要 酶活性 色原性／荧光性底物混合物被酶水解后产生颜色变化 MicroScan Rapid panels、IDS
pH为基础的反应
（通常15~24h） 需要 碳水化合物利用 pH指示颜色变化 碳水化合物分解产酸，蛋白质或含氮化合物被水解产碱 API、Crystal、VITEK cards、 Micro Scan conventional panels
碳源利用 需要 有机物 无色变为紫色 Biolog
挥发性和不挥发酸测定 需要 细胞脂肪酸 气相色谱鉴定终末产物与已知图谱比较 MIDI
肉眼观察生长 需要 各种底物 混浊生长 酵母菌鉴定

半自动化细菌鉴定和/或药敏分析系统
1．VITEK-ATB半自动细菌鉴定和药敏分析系统
VITEK-ATB是生物-梅里埃公司产品，由计算机和读数器两部分组成，计算机程序包括ATB和API的鉴定数据库、ATB的药敏数据库、数据储存和分析系统及药敏专家系统。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机读取结果，由计算机进行分析和处理，并报告细菌鉴定和药敏结果。
2．AutoScan-4半自动细菌鉴定和药敏分析系统
AutoScan-4是由Dade MicroScan公司生产，由计算机和读数器两部分组成。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机，自动判读鉴定和药敏试验结果；亦可人工进行判读，将编码输入计算机，由计算机软件评定结果。有鉴定及鉴定药敏复合板两种测试卡。
3．BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统
BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统是BD公司产品，将传统的酶、底物生化呈色反应与先进的荧光增强显色技术结合以设计鉴定反应最佳组合。反应板在机外孵育后，上机自动判读鉴定结果。配套提供独立分装的鉴定用肉汤试管，确保无菌状态，使用方便。配套比浊仪可快速调配所需浊度的菌液
4．AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统
AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统是Trek Diagnostic Systems LTD.产品，由计算机和读数仪等组成。采用荧光测定法，反应板在机外作定时孵育后，上机读数，由SAMS软件评定测定结果，也可通过SAMS系统人工确认法输入计算，或完全由人工输入作评定。所用鉴定板和药敏板与全自动机型中的反应板是一样的。
5．抑菌圈直径测量仪
抑菌圈直径测量仪有BIOMIC（Giles Scientific Inc），AccuZone System (AccuMed International Inc) ，SIRSCAN (SIRSCAN) 等三种单板读取机，已在临床应用。经孵育后的药敏平板，被仪器的图象分析系统识别并计算抑菌圈直径。根据判断标准，报告药敏试验结果。这些仪器可减少人工测量抑菌圈直径大小差异及主观判断错误。BIOMIC系统宣称能根据抑菌圈大小来计算MIC，值得注意的是该类仪器对抑菌圈内模糊生长或微小的菌落不能正确识别，而这些菌落对细菌的耐药性的判定至关重要，读取每个平板时必须进行人工观察。

（二）全自动的微生物鉴定和药敏试验分析系统
1．VITEK 系统
VITEK AMS是由生物-梅里埃公司生产的全自动微生物鉴定和药敏分析系统。第一代产品有以下四个规格VITEK AMS 32、60、120、240。由计算机主机、孵育箱/读取器、充填机/封口机、打印机等组成。鉴定原理是根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果。在每张卡上有30项生化反应。由计算机控制的读数器，每隔1h对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值，并自动打印出实验报告。

获得细菌的纯培养后，调整菌悬液浓度，根据不同的细菌选择相应的药敏试验卡片，在充液仓中对卡片进行充液。置孵育箱／读数器中孵育，自动定时测试、读取数据和判断结果。VITEK可快速鉴定包括各种肠杆菌科细菌、非发酵细菌、苛氧菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌和酵母菌等500种临床病原菌。具有20多种药敏测试卡、97种抗生素和测定超广谱β-内酰胺酶测试卡，快速检测细菌药敏情况。

该系统有根据细菌耐药规律而设定的专家系统，可帮助校正和修改结果。对于专家系统提示的不可能的或极少见的耐药表型应予以充分重视，需采用确认试验重新鉴定。如对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌，对泰能耐药的肠杆菌，对青霉素耐药的β溶血性链球菌等。

VITEK-2是生物-梅里埃公司开发的新一代微生物分析仪，其工作原理与VITEK AMS没有大的差别，但它的容量更大，自动化程度更高，并且使用64孔的反应卡片，鉴定更准确可靠，可同时测定20种抗生素的药敏试验。

2. MicroScan Walk/ Away系统
MicroScan Walk/ Away系统由主机、真空加样器、孵育箱/读取器、计算机、打印机等组成。除采用传统呈色反应法外，同时采用敏感度极高的快速荧光测定技术来检测细菌胞外酶，鉴定板有普通板和快速板两种，普通板获得结果需要16~18h，快速板测定只需2~3.5h。该系统有8种鉴定反应板，可鉴定包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、酵母菌、嗜血杆菌和奈瑟菌等近800种细菌。药敏部分采用比浊法进行测定，90％菌株可在5.5h内获得对17~33种抗菌药物的MIC值。此系统有walk / Away－40和96两个型号，40或96分别代表该系统可同时容纳40或96个测试板。

3．PHOENIXTM 系统
PHOENIXTM System是新一代全自动快速细菌鉴定/药敏系统，由BD公司生产。鉴定试验采用BD专利荧光增强技术与传统酶、底物生化呈色反应相结合的原理。药敏试验采用传统比浊法和BD专利呈色（Chromogenic）反应双重标准进行药敏试验结果判断。仪器由主机、比浊仪、微生物专家系统等组成。有PHOENIXTM 100或50 二种型号。PHOENIXTM 100型分别可进行100个鉴定试验和100个药敏试验。可鉴定革兰氏阳性菌139种、革兰氏阴性菌158种。有鉴定板、药敏板或鉴定/药敏复合板3种可供选择。每个鉴定药敏复合板有51孔用于鉴定试验，85孔用于药敏试验，可同时进行17种抗菌素5种浓度或28种抗菌素3种浓度的MIC药敏试验。90%细菌的鉴定在3~6h完成，鉴定准确率大于90%，85%的细菌药敏试验在4~6h内出结果。

4．SENSITITRE　ARIS系统
该系统由计算机主机、孵育箱/读数仪、全自动加样器等组成。在培养箱中设置可存放64块板的转盘，每块板均能检测3个标本，故同时可检测192个菌种标本。在测定板底物中加入酶基质，使其与细菌产生的酶结合成荧光物质。在较短时间内能够分析不同生化底物所反映出的荧光物质，通过荧光读数仪检测板孔中荧光Biocide和Willcox值来鉴定细菌。该系统的药敏试验有两种测定法，即当采用人工判定时为比浊法，当采用仪器自动判读时为荧光测定法。但均参照NCCLS的标准和规则来解释结果。大多数菌种均可在5小时内报告检验结果。通常有革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、苛氧菌及真菌鉴定板和300多种抗菌药物不同组合的药敏板及鉴定/药敏复合板。

(三)使用自动化鉴定仪的局限性
1．自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。目前为止，尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定资料。对细菌的分类是根据传统的分类方法，因此鉴定也以传统的手工鉴定方法为“金标准”。使用自动化鉴定仪的实验室，应对技术人员进行手工鉴定基础与操作技能培训。
2．细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变，使用自动化鉴定仪的实验室应经常与生产厂家联系，及时更新数据库。实验室技术人员应了解细菌分类的最新变化，便于在系统更新之前即可进行手工修改。
3．通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。

三、自动化的血液细菌培养系统
正常血液是无菌的，细菌侵入可导致菌血症、败血症、脓毒血症，及时准确地进行病原学诊断极为重要。传统的血培养是抽取5ml血液注入血培养瓶中，放入孵箱，每天观察结果，费时费力，不能及时发阳性结果，易延误诊断。
全自动血液细菌培养仪主要优点是可以在较短培养时间内提示出血液培养瓶中有无微生物的存在。

1．BACTEC系列
BACTEC460、NR-730是早期的血液培养仪，目前基本上已被BACTEC9000系列替代（包括9050、9120和9240三种型号，可分别容纳50、120和240个培养瓶）。微生物在生长过程中消耗培养基内的营养物质，产生的二氧化碳直接激活瓶底部预埋的对二氧化碳浓度变化高度敏感的荧光物质，在激发光的激发下放出荧光，荧光的强度变化直接反映瓶内二氧化碳浓度变化，来判断瓶内有无微生物生长。根据不同的培养要求，该系统配置了标准需氧／厌氧培养瓶、有中和抗菌药物的树脂培养瓶、厌氧菌和真菌等多种培养瓶。细菌培养生长曲线、结果等均可在联机的计算机上显示出来。
2．BacT／Alert系统
该系统有BacT／Alert48、72、96、120、240及3D等型号。主要测定原理为当培养瓶内有微生物生长，代谢过程中产生的二氧化碳可经过半透膜渗透至瓶底，与固定于瓶底的Novel／CO2感应器结合，产生颜色变化，通过光电检测得知二氧化碳变化情况。通过计算机处理后，在曲线图上反映、分析、判断阴性或阳性结果，并及时报警。该系统可在任何时间内放入培养瓶，通过条码识别允许该标本进入系统，并连续跟踪监测。系统配置有需氧培养瓶、厌氧培养瓶、中和抗生素需氧瓶、中和抗生素厌氧瓶、小儿培养瓶、血液分枝杆菌培养瓶和痰液分枝杆菌培养瓶等。
3. VITAL系统
主要测定原理为使用均质荧光技术的快速培养系统，培养瓶内的液体培养基中含有荧光底物，当细菌生长后，产生的质子、电子和离子与荧光分子结合后，使荧光物变成无荧光化合物，通过测量每瓶内荧光强度来反映细菌生长情况。
4．ESP血培养系统
主要测定原理为细菌在生长过程中消耗氧，产生氮气、氢气和二氧化碳，导致培养瓶内压力改变。该系统采用气压传感技术，通过压力传感器监测瓶内压力变化，报警提示有细菌生长。

四、结核分枝杆菌快速检测系统
结核分枝杆菌的经典培养是将标本接种在特定培养基上，定时观察，15天后生长的为可疑菌落。判定阴性需8周时间，要完成阳性病例的鉴定、药物敏感试验需2~3个月，且阳性率低，不易标准化。二十世纪七十年代以来，采用14C棕榈酸作为底物快速检测结核分枝杆菌，使快速分离及鉴定结核分枝杆菌成为可能。第一代的仪器为BD公司的BACTEC 460TMTB培养仪，由于14C的放射性环境污染及探针穿刺开放等缺陷，基本上已被淘汰。BACTEC 9000系列为了克服放射性的缺陷，改用荧光增强技术。由于分枝杆菌的生长需要添加一定浓度的二氧化碳，因此检测培养瓶中氧浓度的变化比二氧化碳浓度的变化更加敏感直接。BACTEC 9000系列利用对氧浓度敏感的荧光物质，来测定培养瓶中结核分枝杆菌的生长。BACTECTMMYCO／FTIC（含溶血素分枝杆菌／真菌培养瓶）适用于血液及无菌体液中结核分枝杆菌和真菌的检测。由于添加了溶血素，破坏了红细胞等血细胞对氧的利用，避免了假阳性。BACTECTMMYCO／FSPuta培养适用于其它污染标本的使用。在此二种瓶中有阳性生长时，需鉴别是结核分枝杆菌还是真菌及其它细菌生长所引起的阳性，它们仅适用于结核分枝杆菌的筛查。

BACTEC960和BacT／ALERT3D系统，可进行结核分枝杆菌的初代培养、阳性结果的鉴定和药敏试验。通过对标本的消化处理后，接种分枝杆菌快速培养管。培养管的基本组成为：①改良Middle Brook 7H9分枝杆菌专用增菌肉汤。②抗菌剂 两性霉素B，阿洛西林，奈啶酸，多粘菌素B，甲氧嘧啶，万古霉素。③营养添加剂。平均阳性检出时间为9~13d，鉴定4~5d。大大加快了结核分枝杆菌的检出。

还有一些适用于小型实验室的手工结核分枝杆菌快速鉴定系统。包括标本前处理管、结核分枝杆菌快速生长管、鉴定试验管、药敏试验管及荧光判读器。

二、自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统
自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统在临床微生物实验室的应用，为微生物检验工作者对病原菌的快速诊断和药敏试验提供了有力工具。鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。各种微生物鉴定系统的反应基础见表6-4-4。

药敏试验分析系统的基本原理是将抗生素微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育，通过测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。在含有抗生素的培养基中，浊度的增加提示细菌生长，根据判断标准解释敏感或耐药。

表 6-4-4 各种微生物鉴定系统的反应基础

系统源性 需要培养 分析 阳性结果指示 系统举例
酶谱分析
(通常2~4h) 不需要 酶活性 色原性／荧光性底物混合物被酶水解后产生颜色变化 MicroScan Rapid panels、IDS
pH为基础的反应
（通常15~24h） 需要 碳水化合物利用 pH指示颜色变化 碳水化合物分解产酸，蛋白质或含氮化合物被水解产碱 API、Crystal、VITEK cards、 Micro Scan conventional panels
碳源利用 需要 有机物 无色变为紫色 Biolog
挥发性和不挥发酸测定 需要 细胞脂肪酸 气相色谱鉴定终末产物与已知图谱比较 MIDI
肉眼观察生长 需要 各种底物 混浊生长 酵母菌鉴定

半自动化细菌鉴定和/或药敏分析系统
1．VITEK-ATB半自动细菌鉴定和药敏分析系统
VITEK-ATB是生物-梅里埃公司产品，由计算机和读数器两部分组成，计算机程序包括ATB和API的鉴定数据库、ATB的药敏数据库、数据储存和分析系统及药敏专家系统。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机读取结果，由计算机进行分析和处理，并报告细菌鉴定和药敏结果。
2．AutoScan-4半自动细菌鉴定和药敏分析系统
AutoScan-4是由Dade MicroScan公司生产，由计算机和读数器两部分组成。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机，自动判读鉴定和药敏试验结果；亦可人工进行判读，将编码输入计算机，由计算机软件评定结果。有鉴定及鉴定药敏复合板两种测试卡。
3．BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统
BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统是BD公司产品，将传统的酶、底物生化呈色反应与先进的荧光增强显色技术结合以设计鉴定反应最佳组合。反应板在机外孵育后，上机自动判读鉴定结果。配套提供独立分装的鉴定用肉汤试管，确保无菌状态，使用方便。配套比浊仪可快速调配所需浊度的菌液
4．AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统
AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统是Trek Diagnostic Systems LTD.产品，由计算机和读数仪等组成。采用荧光测定法，反应板在机外作定时孵育后，上机读数，由SAMS软件评定测定结果，也可通过SAMS系统人工确认法输入计算，或完全由人工输入作评定。所用鉴定板和药敏板与全自动机型中的反应板是一样的。
5．抑菌圈直径测量仪
抑菌圈直径测量仪有BIOMIC（Giles Scientific Inc），AccuZone System (AccuMed International Inc) ，SIRSCAN (SIRSCAN) 等三种单板读取机，已在临床应用。经孵育后的药敏平板，被仪器的图象分析系统识别并计算抑菌圈直径。根据判断标准，报告药敏试验结果。这些仪器可减少人工测量抑菌圈直径大小差异及主观判断错误。BIOMIC系统宣称能根据抑菌圈大小来计算MIC，值得注意的是该类仪器对抑菌圈内模糊生长或微小的菌落不能正确识别，而这些菌落对细菌的耐药性的判定至关重要，读取每个平板时必须进行人工观察。

（二）全自动的微生物鉴定和药敏试验分析系统
1．VITEK 系统
VITEK AMS是由生物-梅里埃公司生产的全自动微生物鉴定和药敏分析系统。第一代产品有以下四个规格VITEK AMS 32、60、120、240。由计算机主机、孵育箱/读取器、充填机/封口机、打印机等组成。鉴定原理是根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果。在每张卡上有30项生化反应。由计算机控制的读数器，每隔1h对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值，并自动打印出实验报告。
获得细菌的纯培养后，调整菌悬液浓度，根据不同的细菌选择相应的药敏试验卡片，在充液仓中对卡片进行充液。置孵育箱／读数器中孵育，自动定时测试、读取数据和判断结果。VITEK可快速鉴定包括各种肠杆菌科细菌、非发酵细菌、苛氧菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌和酵母菌等500种临床病原菌。具有20多种药敏测试卡、97种抗生素和测定超广谱β-内酰胺酶测试卡，快速检测细菌药敏情况。
该系统有根据细菌耐药规律而设定的专家系统，可帮助校正和修改结果。对于专家系统提示的不可能的或极少见的耐药表型应予以充分重视，需采用确认试验重新鉴定。如对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌，对泰能耐药的肠杆菌，对青霉素耐药的β溶血性链球菌等。
VITEK-2是生物-梅里埃公司开发的新一代微生物分析仪，其工作原理与VITEK AMS没有大的差别，但它的容量更大，自动化程度更高，并且使用64孔的反应卡片，鉴定更准确可靠，可同时测定20种抗生素的药敏试验。

2. MicroScan Walk/ Away系统
MicroScan Walk/ Away系统由主机、真空加样器、孵育箱/读取器、计算机、打印机等组成。除采用传统呈色反应法外，同时采用敏感度极高的快速荧光测定技术来检测细菌胞外酶，鉴定板有普通板和快速板两种，普通板获得结果需要16~18h，快速板测定只需2~3.5h。该系统有8种鉴定反应板，可鉴定包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、酵母菌、嗜血杆菌和奈瑟菌等近800种细菌。药敏部分采用比浊法进行测定，90％菌株可在5.5h内获得对17~33种抗菌药物的MIC值。此系统有walk / Away－40和96两个型号，40或96分别代表该系统可同时容纳40或96个测试板。

3．PHOENIXTM 系统
PHOENIXTM System是新一代全自动快速细菌鉴定/药敏系统，由BD公司生产。鉴定试验采用BD专利荧光增强技术与传统酶、底物生化呈色反应相结合的原理。药敏试验采用传统比浊法和BD专利呈色（Chromogenic）反应双重标准进行药敏试验结果判断。仪器由主机、比浊仪、微生物专家系统等组成。有PHOENIXTM 100或50 二种型号。PHOENIXTM 100型分别可进行100个鉴定试验和100个药敏试验。可鉴定革兰氏阳性菌139种、革兰氏阴性菌158种。有鉴定板、药敏板或鉴定/药敏复合板3种可供选择。每个鉴定药敏复合板有51孔用于鉴定试验，85孔用于药敏试验，可同时进行17种抗菌素5种浓度或28种抗菌素3种浓度的MIC药敏试验。90%细菌的鉴定在3~6h完成，鉴定准确率大于90%，85%的细菌药敏试验在4~6h内出结果。

4．SENSITITRE　ARIS系统
该系统由计算机主机、孵育箱/读数仪、全自动加样器等组成。在培养箱中设置可存放64块板的转盘，每块板均能检测3个标本，故同时可检测192个菌种标本。在测定板底物中加入酶基质，使其与细菌产生的酶结合成荧光物质。在较短时间内能够分析不同生化底物所反映出的荧光物质，通过荧光读数仪检测板孔中荧光Biocide和Willcox值来鉴定细菌。该系统的药敏试验有两种测定法，即当采用人工判定时为比浊法，当采用仪器自动判读时为荧光测定法。但均参照NCCLS的标准和规则来解释结果。大多数菌种均可在5小时内报告检验结果。通常有革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、苛氧菌及真菌鉴定板和300多种抗菌药物不同组合的药敏板及鉴定/药敏复合板。

(三)使用自动化鉴定仪的局限性
1．自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。目前为止，尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定资料。对细菌的分类是根据传统的分类方法，因此鉴定也以传统的手工鉴定方法为“金标准”。使用自动化鉴定仪的实验室，应对技术人员进行手工鉴定基础与操作技能培训。
2．细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变，使用自动化鉴定仪的实验室应经常与生产厂家联系，及时更新数据库。实验室技术人员应了解细菌分类的最新变化，便于在系统更新之前即可进行手工修改。
3．通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。

三、自动化的血液细菌培养系统
正常血液是无菌的，细菌侵入可导致菌血症、败血症、脓毒血症，及时准确地进行病原学诊断极为重要。传统的血培养是抽取5ml血液注入血培养瓶中，放入孵箱，每天观察结果，费时费力，不能及时发阳性结果，易延误诊断。
全自动血液细菌培养仪主要优点是可以在较短培养时间内提示出血液培养瓶中有无微生物的存在。

1．BACTEC系列
BACTEC460、NR-730是早期的血液培养仪，目前基本上已被BACTEC9000系列替代（包括9050、9120和9240三种型号，可分别容纳50、120和240个培养瓶）。微生物在生长过程中消耗培养基内的营养物质，产生的二氧化碳直接激活瓶底部预埋的对二氧化碳浓度变化高度敏感的荧光物质，在激发光的激发下放出荧光，荧光的强度变化直接反映瓶内二氧化碳浓度变化，来判断瓶内有无微生物生长。根据不同的培养要求，该系统配置了标准需氧／厌氧培养瓶、有中和抗菌药物的树脂培养瓶、厌氧菌和真菌等多种培养瓶。细菌培养生长曲线、结果等均可在联机的计算机上显示出来。

2．BacT／Alert系统
该系统有BacT／Alert48、72、96、120、240及3D等型号。主要测定原理为当培养瓶内有微生物生长，代谢过程中产生的二氧化碳可经过半透膜渗透至瓶底，与固定于瓶底的Novel／CO2感应器结合，产生颜色变化，通过光电检测得知二氧化碳变化情况。通过计算机处理后，在曲线图上反映、分析、判断阴性或阳性结果，并及时报警。该系统可在任何时间内放入培养瓶，通过条码识别允许该标本进入系统，并连续跟踪监测。系统配置有需氧培养瓶、厌氧培养瓶、中和抗生素需氧瓶、中和抗生素厌氧瓶、小儿培养瓶、血液分枝杆菌培养瓶和痰液分枝杆菌培养瓶等。

3. VITAL系统
主要测定原理为使用均质荧光技术的快速培养系统，培养瓶内的液体培养基中含有荧光底物，当细菌生长后，产生的质子、电子和离子与荧光分子结合后，使荧光物变成无荧光化合物，通过测量每瓶内荧光强度来反映细菌生长情况。

4．ESP血培养系统
主要测定原理为细菌在生长过程中消耗氧，产生氮气、氢气和二氧化碳，导致培养瓶内压力改变。该系统采用气压传感技术，通过压力传感器监测瓶内压力变化，报警提示有细菌生长。

四、结核分枝杆菌快速检测系统
结核分枝杆菌的经典培养是将标本接种在特定培养基上，定时观察，15天后生长的为可疑菌落。判定阴性需8周时间，要完成阳性病例的鉴定、药物敏感试验需2~3个月，且阳性率低，不易标准化。二十世纪七十年代以来，采用14C棕榈酸作为底物快速检测结核分枝杆菌，使快速分离及鉴定结核分枝杆菌成为可能。第一代的仪器为BD公司的BACTEC 460TMTB培养仪，由于14C的放射性环境污染及探针穿刺开放等缺陷，基本上已被淘汰。BACTEC 9000系列为了克服放射性的缺陷，改用荧光增强技术。由于分枝杆菌的生长需要添加一定浓度的二氧化碳，因此检测培养瓶中氧浓度的变化比二氧化碳浓度的变化更加敏感直接。BACTEC 9000系列利用对氧浓度敏感的荧光物质，来测定培养瓶中结核分枝杆菌的生长。

BACTECTMMYCO／FTIC（含溶血素分枝杆菌／真菌培养瓶）适用于血液及无菌体液中结核分枝杆菌和真菌的检测。由于添加了溶血素，破坏了红细胞等血细胞对氧的利用，避免了假阳性。BACTECTMMYCO／FSPuta培养适用于其它污染标本的使用。在此二种瓶中有阳性生长时，需鉴别是结核分枝杆菌还是真菌及其它细菌生长所引起的阳性，它们仅适用于结核分枝杆菌的筛查。

BACTEC960和BacT／ALERT3D系统，可进行结核分枝杆菌的初代培养、阳性结果的鉴定和药敏试验。通过对标本的消化处理后，接种分枝杆菌快速培养管。培养管的基本组成为：①改良Middle Brook 7H9分枝杆菌专用增菌肉汤。②抗菌剂 两性霉素B，阿洛西林，奈啶酸，多粘菌素B，甲氧嘧啶，万古霉素。③营养添加剂。平均阳性检出时间为9~13d，鉴定4~5d。大大加快了结核分枝杆菌的检出。

还有一些适用于小型实验室的手工结核分枝杆菌快速鉴定系统。包括标本前处理管、结核分枝杆菌快速生长管、鉴定试验管、药敏试验管及荧光判读器。

摘自《生物谷》

微生物学检验基本技术(1)