赛尔迪(SELDI)蛋白指纹技术的临床应用与前景
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赵实诚 许洋 |
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蛋白质组学(Proteomics)是近年来生物学领域中发展起来的一门新兴学科，它是研究蛋白质的起源、特征、表达功能以及它与生命发生、发展关系等的一门学科。在医学领域中，通过对蛋白质组学的研究，对了解人类生命的起源、疾病的发生发展规律、疾病的诊断与治疗以及疾病的预防有着重要的意义。随着该学科的迅速发展，蛋白质组学研究普及到各个领域，相关学术组织和机构相继成立。我国经教育部及国家计委批准，由清华大学、北京大学、北京师范大学等36所全国知名大学组建了国家生命科学与技术人才培养基地，并成立了教育部高等学校蛋白质组学研究院。 一 蛋白质组学在医学领域的主要进展 1. 分子医学研究与分子医学时代的到来 蛋白质组学研究的迅速发展与其一系列研究的成功，使医学研究真正进入到了分子水平。通过高通量的技术检测，现在不仅可以在一个多蛋白质的混合体系中(如人体的血液、分泌液、组织液等)对不同类型的蛋白质加以区分，还能准确地测出它的分子量。即便是差1个氨基酸，也能准确地测出来。如与老年性痴呆发病有关的b—淀粉样多肽(b-Amyloid Peptide)，应用以往方法不能确定哪种肽类片段与发病有关，现在可以将其中这种组分和它们的分子量清晰区分开来，并找到与该病发病有关的特殊组分。在人类肿瘤的发生发展过程中，过去对肿瘤临床检测和诊断一直停留在细胞水平上，因此临床医生长期盼望的真正意义上的早期诊断(如实体瘤在尚未形成包块以前，白血病在骨髓细胞检查不能确诊以前)是不可能实现的。 由于分子遗传学的发展，利用基因检查及PCR扩增等技术来检测肿瘤有了一定进展，在临床实践中起到了一定作用，但在肿瘤形成过程中，由于癌基因的突变、扩增和易位到肿瘤的发生是基因表达的复杂过程，它必经过一系列有关因子的作用和调控，因此即便检测到有关癌基因的存在，也不能作为最初肿瘤形成的生物标志物，不能作为临床最初完全确诊的指标。近来发展的DNA甲基化改变检测给肿瘤特异性诊断带来希望，但目前检测的敏感性较低(20~ 40%)，与用特异性抗体检查结果无明显差异。蛋白指纹质谱技术(SELDI，Sur-face Enhanced Laser Desorption/Ionization，表面增强激光解吸技术)是一种高灵敏度、高准确性的检测方法，它能从一个不同成分的混合体系中检查和区分不同组分、不同分子量(差别在1~2个氨基酸之间)的生物标志物(蛋白质)。将来，它可能成为临床上许多疾病检测和诊断的新模式，作为临床检查的常规方法。有人把它称之为分子医学的革命。 2. 基因表达的非线性模式图概念 从遗传基因到基因表达要通过许多未知基因过程的调节，一个基因的表达受许多单基因功能的影响，这种基因间的相互作用，相互影响的复杂性形成了基因表达的非线性模式，因此很难从一个基因水平的检测作出对该基因表达状况的判断。蛋白质是基因表达一系列复杂过程的最终产物，即基因表达的生物学标志，通过对蛋白质水平的监测就能直接了解有关基因的表达水平，从而对疾病作出诊断。 3. 传统特异性检测概念的突破 特异性是指某一物质或某种疾病的专一属性，它是代表某种物质或某种疾病的特征。通过某些特征可以识别某种物质或某种疾病，从而把它和其他物质或疾病区分开来。对专有特征的识别往往依赖于特殊的检测方法，例如要了解某种疾病是否存在有特异性抗原就要用有关特异性抗体来检测。自蛋白质组学研究有新发展以来，这种传统意义上特异性检测和界定方法有了很大的突破。如一种特异性抗原不一定需要特异性抗体来识别，可以通过精密的SELDI检测系统对该抗原(蛋白质)进行多点测定来识别。根据基因到蛋白质表达的复杂过程，一种特异性基因的产物—蛋白质必定有相关多组分蛋白质的表达。通过对这些不同组分的检测形成一个综合模式图(蛋白指纹质谱图)，将这种图谱(如某种肿瘤)与其他图谱(如正常人或其他疾病)相比较，进而识别这种特异蛋白(如肿瘤抗原或其片段)。这种检查并不需要特异性抗体来参与，其特异识别率(阳性率)达到80~90%。这大大节省了时间、劳力和经费。 4. 蛋白质组学研究大大推动了医学领域研究进展 在艾滋病感染人群中，有2~3%的人并不发病。自1986年以来，经过一系列研究，认为是被称之为“CAF”的抑制因子抑制了HIV-1的复制，但对其确切机理并不十分清楚。2002年著名艾滋病鸡尾酒疗法创立者何大一教授借助SELDI技术，在短短3个月内的时间里检测出这种抗HIV的物质是由三种(a-defensin 1、2、3)物质所组成，这推动了抗艾滋病生物药的开发和研究。自SELDI蛋白质指纹质谱技术应用于临床以来，在许多疾病特别是肿瘤的诊断和早期诊断方面有了突破性的进展。美国、欧洲和中国等在3年时间里，对近20种肿瘤进行了蛋白质组学检测，结果显示检测的敏感性和诊断阳性符合率均达到80~90%以上，最高达到99%; 特别是肿瘤的早期诊断，在临床和其他方法尚不能确诊的情况下，SELDI蛋白指纹质谱检测已显示为阳性。根据美国一组报告，通过SELDI蛋白质指纹质谱检测，不仅能将前列腺癌病人、前列腺肥大病人与正常人正确区分开来，而且能从存放5~10年的前列腺癌病人临床发病前、PSA检测尚为阴性的血清中检测出与前列腺癌相关的生物标志物。这证明肿瘤的早期诊断是完全可能的，为肿瘤病人的有效治疗乃至彻底治疗带来希望。 二 蛋白质组学检测技术上的重大创新 一切科学研究重大成果的取得及理论上的重大突破，往往缘于它研究工具和研究方法的创新。蛋白质指纹质谱检测系统的创新是将现代生物学技术(蛋白芯片)、现代物理学技术(激光检测系统)和现代信息技术(BPS软件分析系统)完整结合。 蛋白质有许多传统检测技术，如酶联免疫吸附试验(ELISA)、双相电泳技术、激光捕获微切割(LCM)技术、Western Blot及荧光差异凝胶电泳(DIGE，Differential Gel Electrophoresis)等。这些检测技术在蛋白质检测中均起到不同的作用，为基础研究和临床诊断等提供各种有用的资料。但综合其缺点主要有: 有的检测需特异标志物—抗体，而单抗制备需要经过筛选提纯等一系列复杂过程; 有的检测需有大量的标本，假如标本为一种混合物(如组织液等)，则标本在检测前需要进行蛋白提取，从而限制了应用范围; 有的需要进行染色，如DIGE; 有的不能将一种蛋白质各个组分特别是小分子量组分完全分开，如双相电泳、Western Blot等; 而SELDI指纹质谱技术克服了上述缺点，它可以对各种样本直接进行分析，特点是微量、精确、简易、快速，适用于基础、临床等各个领域。它形象地将检查结果比喻为指纹或超级市场中各种商品上的条码标签，通过检测分析系统就能识别被测的是哪一种蛋白，可见其精密程度。 SELDI蛋白指纹质谱技术，在吸收传统质谱技术优点的基础上，克服了MALDI(基质辅助激光解吸附)传统技术中某些缺点，创造性地增加了特异蛋白芯片阅读系统，可称作蛋白质检测技术最新一代或第四代产品。 SELDI技术的蛋白芯片—飞行时间质谱仪由三部分组成，即蛋白芯片阅读器(ProteinChiundefined Reader)、飞行时间质谱检测系列(PBSIIc系列)和分析软件(ProteinChip软件)。其独家特有的蛋白芯片阅读器是其技术的核心，通过化学表面与生物表面两类芯片可以捕捉到所要求检测的各种蛋白质。 三 SELDI蛋白芯片 根据不同蛋白质化学特性: 疏水、亲水、阳离子、阴离子、金属离子亲和等以及抗原抗体结合、受体配体结合及脱氧核糖核酸与蛋白质结合等生物学特性，专家们发明了化学表面芯片与生物表面芯片两类芯片。 这样可以将多种性质不同的待测蛋白质被捕捉到相应芯片的芯池中，芯池中的被测蛋白质通过激光解吸等过程，经过质谱检测系统检测，再通过BPS软件系统分析，最后将结果绘制成蛋白指纹质谱图，从而将正常人与患某种疾病病人区分开来。 化学芯片又分为疏水、亲水、阳离子、阴离子、金属芯片等五种，可以直接对未经处理的任何生物样品(如血清、体液、组织液、尿液、细胞培养或裂解液等等)进行分析，迅速发现多个生物标志物。生物表面芯片又分为抗原—抗体、受体—配体及脱氧核糖核酸蛋白质等三种，该类芯片特异性高，可以鉴定未知抗原蛋白质等，以减少测定蛋白质序列的工作量，利用定量抗体对抗原进行定量分析。生物芯片功能广，如利用抗体芯片可解决传染病窗口期检测、替代Western Blot、补充流式细胞仪的某些不足，而敏感性和特异性均高于流式细胞仪。精细的分析软件系统对样品进行检测程序、条件等自动化设计和调试，对检测结果进行自动化处理、存储、建立数据库、绘制图形等。 四 SELDI基本工作原理和特点 1. 基本工作原理 利用激光脉冲辐射使芯池中的待测分析物解吸形成电荷，根据不同质荷比，这些解吸的离子在仪器测试场中飞行时间长短不一，分子量大的时间长，分子量小的时间较短，由此绘制出被测物质的质谱图，该图经计算机特殊软件处理还可绘制成模拟图谱，同时显示各种蛋白质的分子量、含量等多种信息。将一个人蛋白质的测定图谱与正常人或某种疾病(如老年性痴呆、肿瘤等)的图谱或基因库中的图谱相对照，就能知道这个人的图谱是正常或是患有某种疾病，或是存有某种尚未明了的新的特异蛋白生物标志物。 2. SELDI技术主要特点
SELDI技术是美国NIH、NCI、FDA和中国教育部高等学校蛋白质组学研究院的核心技术，也是2002年诺贝尔化学奖的应用技术。其多项研究成果发表在Nature、Science、Lancet等30余种著名杂志上。
赵实诚先生，博士，美国史隆—凯特林肿瘤研究所研究员; 摘自《世界医疗器械》 出版日期：2004年8月 |
