【共享】免疫共沉淀原理和实验步骤：试剂准备
丁香园论坛
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免疫共沉淀原理及实验方法
免疫共沉淀
一 原理：
IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的「prorein A" 特异性地结合到免疫球蛋白的 FC 片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在 IP 反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。
其 次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管 它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封 闭，影响与抗体的结合，即使 IP 成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。
每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在 beads 上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。(待续)
二 准备：
器械
#微量高速冷冻离心机
#移液枪
#旋转盘
#电泳设备
#vortex 震荡器
#液氮及组织粉碎器
#eppentube
试剂
#细胞或组织
#蛋白定量 kit
#SDS 电泳试剂
#抗体 (单抗时选择 protein G, 二抗选择抗鼠 Ig 兔血清)
#PBS
#NaN3
#proteinA sapharose
试剂配制
抗原蛋白溶解缓冲液
1.RIPA 缓冲液 (最终浓度)
1MTris-HCL(PH7.4) 5 ml (10 mM)
5MNacl 15 ml (150 mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5 ml (5 mM)
20%TritonX-100 25 ml (1%)
10% DOC 50 ml (1%)
10%SDS 5 ml ( o.1%)
TLCK 18.5 mg (0.1 mM)
TPCK 35 mg (0.2 mM)
DDW 395 ml
toal 500 ml
另外，使用之前加 1 mMPMSF(PMSF 溶在酒精，浓度 100 mM，-20 度遮光保存。注意不易溶于水)
2.NP40 lysis 缓冲液
1MTris-HCL(PH7.4) 5 ml (10 mM)
5MNacl 15 ml (150 mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5 ml (5 mM)
20%NP40 25 ml (1%)
TLCK 18.5 mg (0.1 mM)
TPCK 35 mg (0.2 mM)
DDW 450 ml
toal 500 ml
使用前加 1 mM 的 PMSF
注意点：
~undefinedTris 缓冲剂 PH 随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后 PH 增高。
~undefined反复使用 PMSF 要注意保管方法。
~undefined1 和 2 的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40 是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC<SDS 是离子性的强活性剂。注意忘 记加 TritonX-100，只加 DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。1 的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2 的作用温和，却可能造成抗原 溶解不全。
~undefined两方都有 EDTA，对抗原而言，二价离子 Mg,Ca 等是必要的。根据自己需要调节。EDTA 用 NaOH 滴定。
Protocol
1 调制 protein A sapharose
protein A sapharose 5 ml 溶于 20 ml 含 0.02%NaN3 的 PBS
离心 2000 转 2 分，去上清，在沉淀加 0.02%NaN3 的 PBS，离心后去上清，重复 2 次，最后沉淀加 20 ml 含 0.02%NaN3 的 PBS，冷藏保存
用单抗做一抗时，把 protein A sapharose 先用抗鼠 Ig 兔血清处理 (每 50ulprotein A sapharose 用 1-5ul 血清)。旋转 1-2 h, 混匀后，再离心 1-2s
去上清后，加 PBS，vortex 混合，离心去上清，重复二次
加含 0.02%NaN3 的 PBS 到原来体积，冷存。避免长期保存。
2．抗原的检出
以下操作全在冰面或 4 度进行
去除细胞培养液，用冷 PBS 洗一次。加 RIPA，溶解后，转移到 eppentube 中用 vortex 混匀。RIPA 的量：6 cm 的培养皿加 1 ml(蛋白质的量为 500 mg/ml), 组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。
30m，15000rpm 离心，上清转移到新 tube 。不用移液枪，直接从 tube 倒进另一个 tube
往上清加抗体，1 ml 加 2-5ul 抗体，冷室内旋转混匀 1 h
加 protein A sapharose50ul，再混匀 1 h
5000rpm 离心 1s, 使 sapharose 沉淀，去上清。往 sapharose 加 RIPA，vortex 混匀，离心，去上清。重复 4 次洗净。
加电泳用 sample 缓冲液 40ul,2m 煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。
3. 注意点
A：不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。
B：对电泳的非特异条带，最后可依次用含 300 mM，1omMNaCl 的 RIPA 洗净各一次。(完)
免疫共沉淀
一 原理：
IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的「prorein A" 特异性地结合到免疫球蛋白的 FC 片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在 IP 反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。
其 次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管 它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封 闭，影响与抗体的结合，即使 IP 成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。
每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在 beads 上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。(待续)
二 准备：
器械
#微量高速冷冻离心机
#移液枪
#旋转盘
#电泳设备
#vortex 震荡器
#液氮及组织粉碎器
#eppentube
试剂
#细胞或组织
#蛋白定量 kit
#SDS 电泳试剂
#抗体 (单抗时选择 protein G, 二抗选择抗鼠 Ig 兔血清)
#PBS
#NaN3
#proteinA sapharose
试剂配制
抗原蛋白溶解缓冲液
1.RIPA 缓冲液 (最终浓度)
1MTris-HCL(PH7.4) 5 ml (10 mM)
5MNacl 15 ml (150 mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5 ml (5 mM)
20%TritonX-100 25 ml (1%)
10% DOC 50 ml (1%)
10%SDS 5 ml ( o.1%)
TLCK 18.5 mg (0.1 mM)
TPCK 35 mg (0.2 mM)
DDW 395 ml
toal 500 ml
另外，使用之前加 1 mMPMSF(PMSF 溶在酒精，浓度 100 mM，-20 度遮光保存。注意不易溶于水)
2.NP40 lysis 缓冲液
1MTris-HCL(PH7.4) 5 ml (10 mM)
5MNacl 15 ml (150 mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5 ml (5 mM)
20%NP40 25 ml (1%)
TLCK 18.5 mg (0.1 mM)
TPCK 35 mg (0.2 mM)
DDW 450 ml
toal 500 ml
使用前加 1 mM 的 PMSF
注意点：
~undefinedTris 缓冲剂 PH 随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后 PH 增高。
~undefined反复使用 PMSF 要注意保管方法。
~undefined1 和 2 的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40 是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC<SDS 是离子性的强活性剂。注意忘 记加 TritonX-100，只加 DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。1 的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2 的作用温和，却可能造成抗原 溶解不全。
~undefined两方都有 EDTA，对抗原而言，二价离子 Mg,Ca 等是必要的。根据自己需要调节。EDTA 用 NaOH 滴定。
Protocol
1 调制 protein A sapharose
protein A sapharose 5 ml 溶于 20 ml 含 0.02%NaN3 的 PBS
离心 2000 转 2 分，去上清，在沉淀加 0.02%NaN3 的 PBS，离心后去上清，重复 2 次，最后沉淀加 20 ml 含 0.02%NaN3 的 PBS，冷藏保存
用单抗做一抗时，把 protein A sapharose 先用抗鼠 Ig 兔血清处理 (每 50ulprotein A sapharose 用 1-5ul 血清)。旋转 1-2 h, 混匀后，再离心 1-2s
去上清后，加 PBS，vortex 混合，离心去上清，重复二次
加含 0.02%NaN3 的 PBS 到原来体积，冷存。避免长期保存。
2．抗原的检出
以下操作全在冰面或 4 度进行
去除细胞培养液，用冷 PBS 洗一次。加 RIPA，溶解后，转移到 eppentube 中用 vortex 混匀。RIPA 的量：6 cm 的培养皿加 1 ml(蛋白质的量为 500 mg/ml), 组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。
30m，15000rpm 离心，上清转移到新 tube 。不用移液枪，直接从 tube 倒进另一个 tube
往上清加抗体，1 ml 加 2-5ul 抗体，冷室内旋转混匀 1 h
加 protein A sapharose50ul，再混匀 1 h
5000rpm 离心 1s, 使 sapharose 沉淀，去上清。往 sapharose 加 RIPA，vortex 混匀，离心，去上清。重复 4 次洗净。
加电泳用 sample 缓冲液 40ul,2m 煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。
3. 注意点
A：不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。
B：对电泳的非特异条带，最后可依次用含 300 mM，1omMNaCl 的 RIPA 洗净各一次。(完)
