免疫共沉淀实验步骤

免疫共沉淀样品制备：

1. 电转染CO-IP质粒入60 cm2 培养瓶，表达48h；

2. 吸干培液；

3. 加入预冷的RIPA Buffer（0.5ml/60 cm2培养瓶），冰上孵育10~3 0min；

4. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中；

5. 4℃，12000 rpm离心10~20 min，立即将上清转移到一个新的离心管中；

6. 准备Protein G/A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；

7. 每1ml总蛋白中加入100 μl Protein G/A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10 min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景 ；

8. 4℃，12000 rpm离心15 min，将上清转移到一个新的离心管中；

9. 测定蛋白浓度，定量，分装后，可以在-80℃保存一个月；

10. 加入一定体积（2 ug）的IP抗体到500 μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异；

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物1h-Overnight；

12. 加入30~50 μl Protein G/A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物3~5 h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）；

13. 2000 rpm瞬时离心5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，彻底吸尽上清；

14. 用60 μl 1×上样缓冲液（加入巯基乙醇或DTT）将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀；

15. 将上样样品煮5 min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5 min变性。

未检测到目得蛋白或蛋白很少：

可能原因	处理方法
样品被蛋白酶降解	添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融
抗体浓度太低	调整IP和/或IB抗体浓度， 必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度
抗抗体亲合力太低	选用适合于IP和/或IB的相应抗体
IP抗体未与agarose珠子结合	选用适合于IP的相应珠子， 正确保存防止变质或干燥
Tag未暴露在融合蛋白构象的表面	改变tag融合表达部位
裂解液严谨度太高	改用低严谨度裂解液

目得蛋白高背景：

可能原因	处理方法
非特异蛋白结合	在无血清培养液中裂解细胞； 在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）
裂解液严谨度太低	改用高严谨度裂解液
实验仪器或液体被污染	使用洁净的仪器或液体
转移膜上的非特异吸附	戴手套， 用镊子夹取， 不要接触膜转移面