(交流)免疫扩散
丁香园论坛
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免疫扩散
l 单向免疫扩散(single immunodiffusion)
1.取一块玻璃板,用水冲洗干净后,再用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台备用。
2.将1% 琼脂糖(agarose)融化,56℃水浴中保温。
3.取15ml 琼脂糖加到56℃预热玻璃管中,加入适量抗血清(约200μl),充分混匀后铺于玻璃板上。
4.待凝胶凝固后打孔(直径3mm)。
5.将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔中,每孔5μl。
6.将凝胶板置于湿盒内,室温过夜(24小时以上)后观察结果。
7.绘制标准曲线,测出样品中相应抗原含量。
8.也可将凝胶板进行压片、干燥和染色。
1)将凝胶板放在一张滤纸上。
2)在凝胶板上倒一些蒸馏水,使所有的孔充满水。
3)在凝胶上覆盖一层滤纸(排除气泡),再在滤纸上放多层吸水纸,之上放一块厚玻璃板,上加重物,使凝胶板承受压力为10~50g/cm2。
4)10min后,将凝胶在0.9% NaCl或PBS(或蒸馏水)中浸洗15min,使凝胶重新吸水。
5)再吸压凝胶板10~20min。
6)若预计凝胶中未沉淀蛋白量较多,浸洗和吸压过程可再重复2~3次。
7)取掉吸水纸(注意保持胶片于玻璃板上),用热风吹干胶片。
8)凝胶板在0.5%考马斯亮蓝(CBB R250或G250)染液中染色5~10min。也可用氨基黑、印度墨汁或偶氮胭脂红染液染色。
9)凝胶板浸泡于脱色液中至背景清晰为止。
10) 热风吹干胶片,染色胶片可长期保存。
l 双向免疫扩散(double immunodiffusion)
1.将两块玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗,晾干后放在水平台上备用。
2.将1% agarose融化后,置56℃水浴。
3.在每块玻璃板上铺15ml agarose(约1.5mm厚),凝固后打孔(直径3mm),孔间距10mm。
4.中心孔加5μl抗血清,周围孔内每孔加5μl抗原样品(抗原抗体预先作系列稀释以获得事宜的抗原抗体比例)。
5.将凝胶板置于湿盒内,室温扩散24h。
6.观察结果。
7.如需要,凝胶板可压片、干燥和染色后保存(见单向免疫扩散)。
l 逆向免疫扩散(reversed immunodiffusion)
1.玻璃板洗净后,用75%乙醇冲洗,晾干,放于平台上备用。
2.用pH8.6, 0.1mol/L巴比妥-巴比妥钠缓冲液(0.12I)配制2%琼脂糖凝胶,融化后,于56℃水浴备用。
3.取2ml琼脂糖凝胶,加入2ml IgG抗原(其浓度为有活性IgG蛋白20μg,用pH8.0巴比妥缓冲液稀释)于56℃水浴中充分混匀,立即在水平板上铺成2.5cm×7cm族胶板。
4.待凝胶固定后打孔,孔距15mm,孔径3mm。
5.被测样品用pH8.6, 0.05mol/L巴比妥-巴比妥钠缓冲液适当稀释后,每孔加10μl,37℃湿盒放置24h。
6.样品含量测定:测定沉淀环直径大小,于逆向扩散抗体标准曲线查出相应的抗体含量,即为被测样品的抗体蛋白量。
7.抗体IgG逆向扩散标准曲线制作:取纯化后标定抗原量的IgG及亲和层析纯化的IgG,先固定抗原量,测出不同抗体量形成沉淀环的关系后,可采取一定范围内抗体量作成沉淀环。然后以沉淀环直径为横坐标,以抗体量为纵坐标在半对数坐标纸上作图。
8.染色及结果保存(见单向免疫扩散)。
l 单向免疫扩散(single immunodiffusion)
1.取一块玻璃板,用水冲洗干净后,再用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台备用。
2.将1% 琼脂糖(agarose)融化,56℃水浴中保温。
3.取15ml 琼脂糖加到56℃预热玻璃管中,加入适量抗血清(约200μl),充分混匀后铺于玻璃板上。
4.待凝胶凝固后打孔(直径3mm)。
5.将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔中,每孔5μl。
6.将凝胶板置于湿盒内,室温过夜(24小时以上)后观察结果。
7.绘制标准曲线,测出样品中相应抗原含量。
8.也可将凝胶板进行压片、干燥和染色。
1)将凝胶板放在一张滤纸上。
2)在凝胶板上倒一些蒸馏水,使所有的孔充满水。
3)在凝胶上覆盖一层滤纸(排除气泡),再在滤纸上放多层吸水纸,之上放一块厚玻璃板,上加重物,使凝胶板承受压力为10~50g/cm2。
4)10min后,将凝胶在0.9% NaCl或PBS(或蒸馏水)中浸洗15min,使凝胶重新吸水。
5)再吸压凝胶板10~20min。
6)若预计凝胶中未沉淀蛋白量较多,浸洗和吸压过程可再重复2~3次。
7)取掉吸水纸(注意保持胶片于玻璃板上),用热风吹干胶片。
8)凝胶板在0.5%考马斯亮蓝(CBB R250或G250)染液中染色5~10min。也可用氨基黑、印度墨汁或偶氮胭脂红染液染色。
9)凝胶板浸泡于脱色液中至背景清晰为止。
10) 热风吹干胶片,染色胶片可长期保存。
l 双向免疫扩散(double immunodiffusion)
1.将两块玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗,晾干后放在水平台上备用。
2.将1% agarose融化后,置56℃水浴。
3.在每块玻璃板上铺15ml agarose(约1.5mm厚),凝固后打孔(直径3mm),孔间距10mm。
4.中心孔加5μl抗血清,周围孔内每孔加5μl抗原样品(抗原抗体预先作系列稀释以获得事宜的抗原抗体比例)。
5.将凝胶板置于湿盒内,室温扩散24h。
6.观察结果。
7.如需要,凝胶板可压片、干燥和染色后保存(见单向免疫扩散)。
l 逆向免疫扩散(reversed immunodiffusion)
1.玻璃板洗净后,用75%乙醇冲洗,晾干,放于平台上备用。
2.用pH8.6, 0.1mol/L巴比妥-巴比妥钠缓冲液(0.12I)配制2%琼脂糖凝胶,融化后,于56℃水浴备用。
3.取2ml琼脂糖凝胶,加入2ml IgG抗原(其浓度为有活性IgG蛋白20μg,用pH8.0巴比妥缓冲液稀释)于56℃水浴中充分混匀,立即在水平板上铺成2.5cm×7cm族胶板。
4.待凝胶固定后打孔,孔距15mm,孔径3mm。
5.被测样品用pH8.6, 0.05mol/L巴比妥-巴比妥钠缓冲液适当稀释后,每孔加10μl,37℃湿盒放置24h。
6.样品含量测定:测定沉淀环直径大小,于逆向扩散抗体标准曲线查出相应的抗体含量,即为被测样品的抗体蛋白量。
7.抗体IgG逆向扩散标准曲线制作:取纯化后标定抗原量的IgG及亲和层析纯化的IgG,先固定抗原量,测出不同抗体量形成沉淀环的关系后,可采取一定范围内抗体量作成沉淀环。然后以沉淀环直径为横坐标,以抗体量为纵坐标在半对数坐标纸上作图。
8.染色及结果保存(见单向免疫扩散)。