（交流）免疫扩散
丁香园论坛
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免疫扩散
l 单向免疫扩散（single immunodiffusion）
1．取一块玻璃板，用水冲洗干净后，再用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平台备用。
2．将1% 琼脂糖（agarose）融化，56℃水浴中保温。
3．取15ml 琼脂糖加到56℃预热玻璃管中，加入适量抗血清（约200μl），充分混匀后铺于玻璃板上。
4．待凝胶凝固后打孔（直径3mm）。
5．将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔中，每孔5μl。
6．将凝胶板置于湿盒内，室温过夜（24小时以上）后观察结果。
7．绘制标准曲线，测出样品中相应抗原含量。
8．也可将凝胶板进行压片、干燥和染色。
1）将凝胶板放在一张滤纸上。
2）在凝胶板上倒一些蒸馏水，使所有的孔充满水。
3）在凝胶上覆盖一层滤纸（排除气泡），再在滤纸上放多层吸水纸，之上放一块厚玻璃板，上加重物，使凝胶板承受压力为10~50g/cm2。
4）10min后，将凝胶在0.9% NaCl或PBS（或蒸馏水）中浸洗15min，使凝胶重新吸水。
5）再吸压凝胶板10~20min。
6）若预计凝胶中未沉淀蛋白量较多，浸洗和吸压过程可再重复2~3次。
7）取掉吸水纸（注意保持胶片于玻璃板上），用热风吹干胶片。
8）凝胶板在0.5%考马斯亮蓝（CBB R250或G250）染液中染色5~10min。也可用氨基黑、印度墨汁或偶氮胭脂红染液染色。
9）凝胶板浸泡于脱色液中至背景清晰为止。
10） 热风吹干胶片，染色胶片可长期保存。
l 双向免疫扩散（double immunodiffusion）
1．将两块玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。
2．将1% agarose融化后，置56℃水浴。
3．在每块玻璃板上铺15ml agarose（约1.5mm厚），凝固后打孔（直径3mm），孔间距10mm。
4．中心孔加5μl抗血清，周围孔内每孔加5μl抗原样品（抗原抗体预先作系列稀释以获得事宜的抗原抗体比例）。
5．将凝胶板置于湿盒内，室温扩散24h。
6．观察结果。
7．如需要，凝胶板可压片、干燥和染色后保存（见单向免疫扩散）。
l 逆向免疫扩散（reversed immunodiffusion）
1．玻璃板洗净后，用75%乙醇冲洗，晾干，放于平台上备用。
2．用pH8.6, 0.1mol/L巴比妥-巴比妥钠缓冲液（0.12I）配制2%琼脂糖凝胶，融化后，于56℃水浴备用。
3．取2ml琼脂糖凝胶，加入2ml IgG抗原（其浓度为有活性IgG蛋白20μg，用pH8.0巴比妥缓冲液稀释）于56℃水浴中充分混匀，立即在水平板上铺成2.5cm×7cm族胶板。
4．待凝胶固定后打孔，孔距15mm，孔径3mm。
5．被测样品用pH8.6, 0.05mol/L巴比妥-巴比妥钠缓冲液适当稀释后，每孔加10μl，37℃湿盒放置24h。
6．样品含量测定：测定沉淀环直径大小，于逆向扩散抗体标准曲线查出相应的抗体含量，即为被测样品的抗体蛋白量。
7．抗体IgG逆向扩散标准曲线制作：取纯化后标定抗原量的IgG及亲和层析纯化的IgG，先固定抗原量，测出不同抗体量形成沉淀环的关系后，可采取一定范围内抗体量作成沉淀环。然后以沉淀环直径为横坐标，以抗体量为纵坐标在半对数坐标纸上作图。
8．染色及结果保存（见单向免疫扩散）。
l 单向免疫扩散（single immunodiffusion）
1．取一块玻璃板，用水冲洗干净后，再用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平台备用。
2．将1% 琼脂糖（agarose）融化，56℃水浴中保温。
3．取15ml 琼脂糖加到56℃预热玻璃管中，加入适量抗血清（约200μl），充分混匀后铺于玻璃板上。
4．待凝胶凝固后打孔（直径3mm）。
5．将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔中，每孔5μl。
6．将凝胶板置于湿盒内，室温过夜（24小时以上）后观察结果。
7．绘制标准曲线，测出样品中相应抗原含量。
8．也可将凝胶板进行压片、干燥和染色。
1）将凝胶板放在一张滤纸上。
2）在凝胶板上倒一些蒸馏水，使所有的孔充满水。
3）在凝胶上覆盖一层滤纸（排除气泡），再在滤纸上放多层吸水纸，之上放一块厚玻璃板，上加重物，使凝胶板承受压力为10~50g/cm2。
4）10min后，将凝胶在0.9% NaCl或PBS（或蒸馏水）中浸洗15min，使凝胶重新吸水。
5）再吸压凝胶板10~20min。
6）若预计凝胶中未沉淀蛋白量较多，浸洗和吸压过程可再重复2~3次。
7）取掉吸水纸（注意保持胶片于玻璃板上），用热风吹干胶片。
8）凝胶板在0.5%考马斯亮蓝（CBB R250或G250）染液中染色5~10min。也可用氨基黑、印度墨汁或偶氮胭脂红染液染色。
9）凝胶板浸泡于脱色液中至背景清晰为止。
10） 热风吹干胶片，染色胶片可长期保存。
l 双向免疫扩散（double immunodiffusion）
1．将两块玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。
2．将1% agarose融化后，置56℃水浴。
3．在每块玻璃板上铺15ml agarose（约1.5mm厚），凝固后打孔（直径3mm），孔间距10mm。
4．中心孔加5μl抗血清，周围孔内每孔加5μl抗原样品（抗原抗体预先作系列稀释以获得事宜的抗原抗体比例）。
5．将凝胶板置于湿盒内，室温扩散24h。
6．观察结果。
7．如需要，凝胶板可压片、干燥和染色后保存（见单向免疫扩散）。
l 逆向免疫扩散（reversed immunodiffusion）
1．玻璃板洗净后，用75%乙醇冲洗，晾干，放于平台上备用。
2．用pH8.6, 0.1mol/L巴比妥-巴比妥钠缓冲液（0.12I）配制2%琼脂糖凝胶，融化后，于56℃水浴备用。
3．取2ml琼脂糖凝胶，加入2ml IgG抗原（其浓度为有活性IgG蛋白20μg，用pH8.0巴比妥缓冲液稀释）于56℃水浴中充分混匀，立即在水平板上铺成2.5cm×7cm族胶板。
4．待凝胶固定后打孔，孔距15mm，孔径3mm。
5．被测样品用pH8.6, 0.05mol/L巴比妥-巴比妥钠缓冲液适当稀释后，每孔加10μl，37℃湿盒放置24h。
6．样品含量测定：测定沉淀环直径大小，于逆向扩散抗体标准曲线查出相应的抗体含量，即为被测样品的抗体蛋白量。
7．抗体IgG逆向扩散标准曲线制作：取纯化后标定抗原量的IgG及亲和层析纯化的IgG，先固定抗原量，测出不同抗体量形成沉淀环的关系后，可采取一定范围内抗体量作成沉淀环。然后以沉淀环直径为横坐标，以抗体量为纵坐标在半对数坐标纸上作图。
8．染色及结果保存（见单向免疫扩散）。
