双向免疫扩散试验

实验五十七 双向免疫扩散试验

　　一、目的要求

　　1．练习双向免疫扩散试验的操作方法。

　　2．观察抗原、抗体在琼脂中形成的沉淀线。

　　3．了解双向免疫扩散试验的用途。

　　二、基本原理

　　抗原、抗体在凝胶中扩散，并进行沉淀反应，叫做免疫扩散反应（immunodiffusion）。将抗原与其相应抗体放在凝胶（如琼脂）平板中的邻近孔内，使它们互相扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位相遇时，即出现乳白色的沉淀线，称为双向免疫扩散试验。此方法是由Ouchterlony所提出，因此又称Ouchter-lony技术。

　　双向免疫扩散试验非但可对抗原或抗体进行定性鉴定和测定效价，还可对抗原或抗体进行纯度分析和同时对两种不同来源的抗原或抗体进行比较，分析其所含成分的异同。

　　若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线（图XIII-9）。因此，利用此法可进行抗原或抗体的纯度分析。　

　　沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距抗体孔越远（图XIII-10），因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据已知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原的浓度；反之固定抗原的浓度，亦可测定抗体的效价。

　　此外观察两个邻近孔的抗原与抗体所形成的两条线是交叉抑或相连，可用来判断该两抗原是否有共同成分（图XIII-11）。假如同样的纯抗原a放在两个邻近的孔中，对应抗体放在中央孔中，两条沉淀线在其相邻的末端会互相连接和融合；若两个不同的抗原a和b，则两线互相交叉；若两个抗原有部分相同成分a和ab，则两线除有相连部分以外还有一伸出部分。

　　三、器材

　　1％离子琼脂（配法见附录Ⅲ），兔抗马血清，马血清，牛血清，山羊血清，人血清；

　　方阵型打孔器或单孔金属管（孔径约3mm），吸管，毛细滴管，2．5×7cm载玻片、注射针头，含湿滤纸或湿纱布的培养皿或带盖搪瓷盒。

　　四、操作步骤

　　1．在沸水浴中溶解1％离子琼脂。

　　2．冷至50—60℃左右，吸3．5—4ml加在载玻片（必须放在水平位置）上，使其均匀布满玻片而又不流失。

　　3．琼脂凝固后，取方阵型打孔器打孔，或单孔金属管按图XIII—12打孔，再用注射针头挑去孔中琼脂。每琼脂板打两个方阵型（图XIII—12）。

　　4．用记号笔在琼脂板的底面将孔编号。

　　5．用毛细滴管加兔抗马血清抗体于两个方阵型的中央孔中，第一方阵型的周围孔1加牛血清，孔2加马血清，孔3加羊血清，孔4加入血清。第二方阵型周围各孔加入的抗原与第一方阵型相同，但浓度均改为1：20。注意所加血清与抗血清不能溢出孔外。

　　6．将玻片放入有湿滤纸的培养皿或有盖搪瓷盒内。

　　7．置37℃温箱，24—48小时后取出观察结果。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　（1）抗体与抗原之间有沉淀线形成为阳性结果，以“ ”表示；无沉淀线为阴性结果，以“-”表示。将结果记录于下表中（抗体为兔抗马血清）。

　　（2）画下两个方阵型与所形成的沉淀线。

　　（3）分别测量两个方阵型中抗原与沉淀线之间的距离，两者有何区别？

　　2．思考题

　　（1）根据所得结果分析马血清与牛血清、羊血清、人血清之间有无共同成分？

　　（2）抗马血清的纯度如何？

　　（3）Ouchterlony技术与在液体中进行沉淀反应的技术相比，有哪些优越性？