DNA分子佐剂增强DNA疫苗免疫效应的研究进展
丁香园论坛
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用DNA分子佐剂增强DNA疫苗免疫效应的研究进展
李再新 张富春
（新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室 乌鲁木齐 830046）
自Wolff等1990年发现DNA能够刺激机体产生免疫效应以来,在全世界范围内迅速掀起了一股DNA疫苗研究热。在近十年的时间里,科学工作者在鼠、鸡、猪、牛、猫、猴和黑猩猩等动物中进行了广泛深入的抗病毒、抗细菌、抗寄生虫、抗肿瘤及免疫不育的DNA疫苗研究。由于DNA疫苗能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,并兼有减毒活疫苗的有效性和亚单位疫苗的安全性, 而且制作简单、经济、易于储存运输等优点已在免疫学领域引起一场重大的革命。近年的研究还表明, 虽然DNA疫苗具有广泛的优越性,但在免疫效力上却还不及活疫苗有效,尚未达到人们的期望值。如何提高DNA疫苗的免疫效应成为研究者关注的热点,本文就利用DNA分子佐剂增强DNA疫苗效果的研究讨论如下:
1 改善免疫途径和免疫方式
不同免疫途径和免疫方式可对抗原DNA的吸收、表达和提呈产生影响,因而诱导出不同的免疫反应强度。目前，普遍采用直接注射器注射法和基因枪注射法,将DNA疫苗导入到机体内。免疫部位常选在骨骼肌、表皮、粘膜和静脉等组织器官。虽然肌肉组织的抗原提呈能力较低,但对质粒DNA的吸收和表达效率很高,并且简单快捷,是最主要的免疫方法之一。为进一步提高肌肉细胞对DNA的吸收表达及降低个体差异,有些研究者选用了普鲁卡因和心肌毒素等再生诱导剂,或在注射前使用25%的蔗糖溶液。Levy等采用纵向肌肉注射方式,即在强光照射下充分暴露肌纤维走向和肌肉组织的结构,使注射方向与肌纤维走向平行,避开结缔组织,将DNA注射到肌腹中，该方法可使蛋白质的表达水平提高100倍以上。但免疫效果却不一定好。由于表皮富含抗原提呈细胞而常被选作基因枪注入的靶位。由于基因枪技术能更好地模拟外源异物入侵机体的自然过程,使DNA疫苗更有效的发生转染和有效的抗原提呈相结合,因此成为目前广泛应用且十分高效的免疫方法,它比普通的注射法低 2～3个数量级的DNA量即可产生较高的保护作用。
Leitner等将编码疟原虫环子孢子抗原的质粒通过肌注途径和基因枪介导的表皮途径免疫BALB/C小鼠。结果表明：表皮免疫产生的抗体及保护效率都显著高于肌注途径。同时还发现,就间隔时间及免疫次数而言,表皮途径以 45天为间隔及三次免疫效果为最佳,比以28天为间隔产生的IgG效价高出近30倍,并且诱导Ig2a的产生。对此可能是间隔时间较短时,上一次免疫残留的抗体将清除下一次免疫后产生的低表达量的抗原,或残留的效应细胞在28天时仍处于活跃状态,能清除产生抗原的细胞。有人比较了肌注途径与表皮基因枪途径产生的IgG亚类的不同,认为肌注途径开始时主要诱导TH1型反应,而表皮免疫开始时主要诱导TH2型反应。TH1有助于细胞免疫形成, TH2则辅助Ｂ细胞分化成抗体分泌细胞, 与体液免疫相关。另一有关HCVE2基因免疫原性的研究也得出类似的结论:基因枪介导的内皮免疫诱导产生的抗体无论在效价还是在持久性上均优于肌注途径。
2、选择、优化免疫刺激序列及载体
Sato等发现,虽然含Kan基因的质粒表达β-Gal的水平比含Amp抗性基因的质粒高,但含Kan基因的质粒却并不诱导明显的免疫反应;相反,含Amp基因的质粒却能显著增强抗原特异性的体液免疫和细胞免疫应答。研究表明, 这是由于Amp基因中含有未甲基化的5′PurpurCGyrPyr3′回文序列。该序列能诱导单核细胞产生IL-12,刺激TH1细胞分泌IFN、TNF等细胞因子,使TH2型反应向TH1型反应转变。因此称之为“免疫刺激DNA序列”(ISS)。ISS的精确序列及在质粒中所处位置对DNA免疫都有影响。含CpG的免疫刺激序列不仅能增强DNA的免疫,还能直接增强蛋白质的免疫。1998年,Lee等对CpGDNA的佐剂效应作深入的研究可证实这点：当用95ug的质粒载体pCIN(含ISS)和5ug表达流感病毒凝集素(HA)的质粒pCIN HA共注射小鼠后,得到的CTL效应和T细胞增殖率比单注射5ug或100ug的pCINHA高,特异性IgG与注
射100ug的pCINHA相当。但IgG2a/IgG1较低,抗体谱仍以IgG2a为主。然后他们把HA抗原换成流感病毒的核心蛋白NP重复上述试验,结果显示NP特异的CTL效应亦增强,但IgG水平下降,IgG2a/IgG1却升高了。所以,总体而言,CpGDNA一方面加强了不同DNA疫苗的TH1型反应,另一方面又因抗原不同而产生有差异的调制效应。但ISS起佐剂作用的具体机制并不清楚。
3 DNA疫苗与其他抗原DNA佐剂的共表达刺激
分子生物学技术的发展有助于人们可以将多种表达抗原构建到同一载体上增强DNA疫苗免疫效力。Major等构建了分别表达HCV核心蛋白表位 (核心蛋白的前58个氨基酸,能被B细胞和CTL识别)或HBsAg的非嵌合质粒及同时表达这两种抗原的嵌合质粒，所有的质粒在体外翻译系统中都能有效地表达融合或非融合蛋白，但当它们转染细胞时,非嵌合型HCV抗原质粒转染的细胞中未检测到HCV抗原的表达,而嵌合型质粒却能表达出两种病毒的抗原。与此相对应,非嵌合型质粒通过肌注途径免疫的小鼠在14周以后都检测不到抗HCV抗体,而嵌合型质粒免疫的小鼠在6周内全部都产生了高效价的HCV抗体。据推测,嵌合型质粒表达的融合蛋白有利于稳定HCV核心蛋白,从而有利于抗原提呈,并产生针对它的免疫反应。俄罗斯春季脑炎病毒和中欧脑炎病毒为同种亚类病毒,Schmljohn等[1]将分别将其编码二者PrM/E基因的质粒DNA免疫小鼠,能诱导小鼠产生很高的同源及交叉保护力,保护时间长达2～6个月。口蹄疫病毒能在牲畜间引起严重的疾病,Ward等[2]将膜受体结合位点有缺陷的口蹄疫病毒全长基因组cDNA和HDV核酶序列克隆到CMV启动子下游。构建的质粒转染细胞后能复制出病毒颗粒,但这些病毒颗粒由于不能进一步感染正常细胞,从而不能进行第二轮复制,亦不会引起乳鼠死亡。用该质粒免疫20～40Kg重的猪能诱导产生中和抗体,并对猪形成一定的保护力。该DNA疫苗区别于传统DNA疫苗的地方在于由它编码的RNA能进行自我复制并产生多种抗原,与前面提到的Sindbis毒载体pSIN表达外源基因极为相似。
4 DNA分子佐剂增强DNA疫苗免疫效果
IL-2可作用于多种细胞,包括T、B淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞等,对免疫应答具有广泛的上调作用。1994年,Chow等[3]将IL-2应用于HBVDNA疫苗的研究中显示: 给小鼠肌肉注射1ug的PS2-S/PIL-2(S2-S表示HBV中蛋白)或pS2-S-IL-2得到的抗体滴度和CD4+T细胞增殖均相当于单独注射100ug的PS2-S。CD4+T细胞增殖均相当于单独注射100ug的pS2-S。当注射等量的各质粒时, 体外检测脾细胞分泌的各种细胞因子量,发现IL-2大幅度地加强了IFN-γ、IL-2的分泌,而对IL-4只有轻微的加强,说明IL-2主要是加强了机体的TH1型免疫应答。同时还发现IL-2有助于打破免疫耐受。Barouch等的研究结果却是,单独表达IL-2的质粒不能增强HIVgp120DNA疫苗诱发的免疫应答,只有表达IL-2/Ig融合蛋白的质粒才能明显地增强特异性抗体产生和T细胞增殖,而且这种增强效应必须在注射gp120DNA2天或5天后再注射IL-2/Ig表达质粒才有效,如果同时或提前注射则没有任何效应,甚至产生下调效应。Barouch等gp120蛋白本身就是一极强的抗原, 有可能同一细胞因子对编码不同抗原DNA疫苗的反应不一致。Kin等报告当把Gag/pol基因换为HIV的Env基因或Vif基因或Nef基因时,IL-12同样对CTL效应具明显增强作用,但对体液免疫应答则起抑制作用,表现为抗体滴度下降和B细胞减少。同样,Tsuji等也发现IL-12的表达质粒能加强HIVEnvDNA疫苗诱生的DTH和CTL效应, 同时使内源性的IFN-r大幅度上升,但对体液免疫则无任何显著影响。另外有报道说IL-12能够协助无任何免疫原性的流感病毒突变型核心蛋白DNA疫苗诱生强有力的CTL活性[4]。许多学者对IL-4、GM-CSF、免疫刺激调节分子CD154作了大量的研究发现：由Th2亚群产生IL-4，具有调节B细胞、T细胞、肥大细胞和巨噬细胞免疫作用。刺激B细的增殖，增强B细胞、巨噬细胞提呈抗原能力，使免疫系统对小量抗原刺激发生免疫应答[5]。IL-4增强IgG1和IgE表达水平，IL-4还可促进休止期B细胞的早期活化，从Go期进入G1期,细胞体积增大,并表达CD25。IL-4作为肿瘤免疫调节剂已进入Ⅱ期临床试验[6]。GM-CSF在免疫应答反应中,主要通过调节抗原递呈细胞的数量和功能来增强免疫应答强度。Geissler等[7]把表达GM-CSF的质粒与HCV核心抗原DNA疫苗共注射小鼠后,小鼠抗体阳转率比单独注射该疫苗高2倍。不仅如此,Cho等[8]还发现GM-CSF与抗原共质粒表达效果更好。Barouch等[9]则报道GM-CSF的佐剂效应在迟注射DNA疫苗后方可体现。免疫刺激调节分子CD154(即CD40Ligand)是T细胞上表达的CD40的配体,它与CD40的结合将刺激表达CD40分子的抗原提呈细胞增殖分化,并表达共刺激分子,从而放大抗原诱导的免疫应答。Mandoza等[10]将表达CD40L的质粒pCD40L和表达的质粒lacZ肌注或皮下免疫下鼠,发现pCD40L确实增强DNA疫苗诱导的体液及细胞免疫效应。除此之外，科研工作者还对其他分子佐剂如IL-5、6、7、18@@ ,B7-2等研究。
5．凋亡信号分子和泛素佐剂
当肌细胞、角化细胞等吸收了抗原DNA后，渐渐形成凋亡体，凋亡体被专职APC细胞识别吸收。在APC细胞正常清除凋亡小体时，抗原DNA继续表达。同时，APC细胞则通过免疫途径1将免疫信号提呈给CD8+T细胞。日本的Shin Sasaki等人将凋亡信号分子（Caspase1DNA）作简单的突变，减少细胞凋亡速度、延长凋亡时间，然后将此分子与红血球凝聚素（hemagglutinin）和淋巴细胞脉络丛脑炎病毒的核心蛋白(NP)DNA疫苗共表达。结果，显著地增加T细胞反应，但细胞免疫强于体液免疫。
细胞内源性蛋白的降解主要通过泛素途径。泛素是一种由76个氨基酸组成的蛋白质分子,其C端为—Gly。当要降解的底物蛋白被识别后,其Lys与泛素末位Gly共价结合,其它泛素分子的Gly再顺次结合到前一分子的Lys上,形成多聚泛素--底物蛋白复合物,该复合物最终将被蛋白酶体降解。最近,Rodriguez等利用此降解途径,将淋巴细胞脉络丛脑炎病毒的核心蛋白(NP)与泛素蛋白(Ub)融合表达,Ub稍作改动,即将末位的Gly改为Ala,以防止融合蛋白降解为NP和Ub单体。结果,这种泛素化的抗原快速的被降解。NP在胞内的加速降解使得它不能诱导产生体液免疫,但却提高了它被MHC-1类分子识别提呈的机率,从而大大提高了CTL活性和对小鼠的保护效率。Rodriguez用泛素化NP基因免疫的8只小鼠(BALB/C及C57BL/6各4只)在第6周攻毒后全部存活,并且在脾内检测不到L-CMV;而同期未泛素化的NP基因只产生了75%的保护率。这是迄今为止免疫效果最好的DNA疫苗。
6 结语
迄今为止,对于大部分的DNA疫苗的免疫作用,只有在激发机体产生TH1型免疫应答后才能够有效的产生强有力的细胞毒性T细胞的杀伤效应，而对于DNA不育疫苗诱导TH2型免疫应答，激发高效价的IgG就显非常必要的。为此,选择适当的佐剂、载体诱导疫苗的免疫应答分型及加强免疫原性具有非常重要意义,从上述中各种增强DNA疫苗的免疫效应途径来看,学者们探讨了包括上述的载体的品质及各种分子佐剂、佐剂蛋白表达启动子及佐剂添加部位、时相、剂量等促施增强DNA疫苗的免疫效应,虽然到目前为止增强DNA免疫所得到的结果还很不均一。但由于以质粒为载体的细胞因子与其他佐剂相比,它具有许多特有的优点:如，一次少量给予即可维持长时低量表达又不会产生副作用,且无需再频繁连续补给;制备简单成本廉等；尤其是对免疫共刺激分子及免疫刺激调节分子等分子佐剂与DNA疫苗的共同研究将有助于对免疫机制的了解。一旦能得到了各种佐剂确定的影响效应,将会很有助于DNA疫苗的优化,增强其实用性。同时,这些佐剂也可能用于其它类型的疫苗,发挥同样的优化作用。所以,分子佐剂向人们展示了乐观的应用前景, 随着DNA疫苗免疫机制深入的研究及效果的确定,DNA疫苗的免疫原性将发挥广泛作用，达到对其进行人为的调节控制,扬长避短,开辟疫苗领域的新天地。
李再新 张富春
（新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室 乌鲁木齐 830046）
自Wolff等1990年发现DNA能够刺激机体产生免疫效应以来,在全世界范围内迅速掀起了一股DNA疫苗研究热。在近十年的时间里,科学工作者在鼠、鸡、猪、牛、猫、猴和黑猩猩等动物中进行了广泛深入的抗病毒、抗细菌、抗寄生虫、抗肿瘤及免疫不育的DNA疫苗研究。由于DNA疫苗能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,并兼有减毒活疫苗的有效性和亚单位疫苗的安全性, 而且制作简单、经济、易于储存运输等优点已在免疫学领域引起一场重大的革命。近年的研究还表明, 虽然DNA疫苗具有广泛的优越性,但在免疫效力上却还不及活疫苗有效,尚未达到人们的期望值。如何提高DNA疫苗的免疫效应成为研究者关注的热点,本文就利用DNA分子佐剂增强DNA疫苗效果的研究讨论如下:
1 改善免疫途径和免疫方式
不同免疫途径和免疫方式可对抗原DNA的吸收、表达和提呈产生影响,因而诱导出不同的免疫反应强度。目前，普遍采用直接注射器注射法和基因枪注射法,将DNA疫苗导入到机体内。免疫部位常选在骨骼肌、表皮、粘膜和静脉等组织器官。虽然肌肉组织的抗原提呈能力较低,但对质粒DNA的吸收和表达效率很高,并且简单快捷,是最主要的免疫方法之一。为进一步提高肌肉细胞对DNA的吸收表达及降低个体差异,有些研究者选用了普鲁卡因和心肌毒素等再生诱导剂,或在注射前使用25%的蔗糖溶液。Levy等采用纵向肌肉注射方式,即在强光照射下充分暴露肌纤维走向和肌肉组织的结构,使注射方向与肌纤维走向平行,避开结缔组织,将DNA注射到肌腹中，该方法可使蛋白质的表达水平提高100倍以上。但免疫效果却不一定好。由于表皮富含抗原提呈细胞而常被选作基因枪注入的靶位。由于基因枪技术能更好地模拟外源异物入侵机体的自然过程,使DNA疫苗更有效的发生转染和有效的抗原提呈相结合,因此成为目前广泛应用且十分高效的免疫方法,它比普通的注射法低 2～3个数量级的DNA量即可产生较高的保护作用。
Leitner等将编码疟原虫环子孢子抗原的质粒通过肌注途径和基因枪介导的表皮途径免疫BALB/C小鼠。结果表明：表皮免疫产生的抗体及保护效率都显著高于肌注途径。同时还发现,就间隔时间及免疫次数而言,表皮途径以 45天为间隔及三次免疫效果为最佳,比以28天为间隔产生的IgG效价高出近30倍,并且诱导Ig2a的产生。对此可能是间隔时间较短时,上一次免疫残留的抗体将清除下一次免疫后产生的低表达量的抗原,或残留的效应细胞在28天时仍处于活跃状态,能清除产生抗原的细胞。有人比较了肌注途径与表皮基因枪途径产生的IgG亚类的不同,认为肌注途径开始时主要诱导TH1型反应,而表皮免疫开始时主要诱导TH2型反应。TH1有助于细胞免疫形成, TH2则辅助Ｂ细胞分化成抗体分泌细胞, 与体液免疫相关。另一有关HCVE2基因免疫原性的研究也得出类似的结论:基因枪介导的内皮免疫诱导产生的抗体无论在效价还是在持久性上均优于肌注途径。
2、选择、优化免疫刺激序列及载体
Sato等发现,虽然含Kan基因的质粒表达β-Gal的水平比含Amp抗性基因的质粒高,但含Kan基因的质粒却并不诱导明显的免疫反应;相反,含Amp基因的质粒却能显著增强抗原特异性的体液免疫和细胞免疫应答。研究表明, 这是由于Amp基因中含有未甲基化的5′PurpurCGyrPyr3′回文序列。该序列能诱导单核细胞产生IL-12,刺激TH1细胞分泌IFN、TNF等细胞因子,使TH2型反应向TH1型反应转变。因此称之为“免疫刺激DNA序列”(ISS)。ISS的精确序列及在质粒中所处位置对DNA免疫都有影响。含CpG的免疫刺激序列不仅能增强DNA的免疫,还能直接增强蛋白质的免疫。1998年,Lee等对CpGDNA的佐剂效应作深入的研究可证实这点：当用95ug的质粒载体pCIN(含ISS)和5ug表达流感病毒凝集素(HA)的质粒pCIN HA共注射小鼠后,得到的CTL效应和T细胞增殖率比单注射5ug或100ug的pCINHA高,特异性IgG与注
射100ug的pCINHA相当。但IgG2a/IgG1较低,抗体谱仍以IgG2a为主。然后他们把HA抗原换成流感病毒的核心蛋白NP重复上述试验,结果显示NP特异的CTL效应亦增强,但IgG水平下降,IgG2a/IgG1却升高了。所以,总体而言,CpGDNA一方面加强了不同DNA疫苗的TH1型反应,另一方面又因抗原不同而产生有差异的调制效应。但ISS起佐剂作用的具体机制并不清楚。
3 DNA疫苗与其他抗原DNA佐剂的共表达刺激
分子生物学技术的发展有助于人们可以将多种表达抗原构建到同一载体上增强DNA疫苗免疫效力。Major等构建了分别表达HCV核心蛋白表位 (核心蛋白的前58个氨基酸,能被B细胞和CTL识别)或HBsAg的非嵌合质粒及同时表达这两种抗原的嵌合质粒，所有的质粒在体外翻译系统中都能有效地表达融合或非融合蛋白，但当它们转染细胞时,非嵌合型HCV抗原质粒转染的细胞中未检测到HCV抗原的表达,而嵌合型质粒却能表达出两种病毒的抗原。与此相对应,非嵌合型质粒通过肌注途径免疫的小鼠在14周以后都检测不到抗HCV抗体,而嵌合型质粒免疫的小鼠在6周内全部都产生了高效价的HCV抗体。据推测,嵌合型质粒表达的融合蛋白有利于稳定HCV核心蛋白,从而有利于抗原提呈,并产生针对它的免疫反应。俄罗斯春季脑炎病毒和中欧脑炎病毒为同种亚类病毒,Schmljohn等[1]将分别将其编码二者PrM/E基因的质粒DNA免疫小鼠,能诱导小鼠产生很高的同源及交叉保护力,保护时间长达2～6个月。口蹄疫病毒能在牲畜间引起严重的疾病,Ward等[2]将膜受体结合位点有缺陷的口蹄疫病毒全长基因组cDNA和HDV核酶序列克隆到CMV启动子下游。构建的质粒转染细胞后能复制出病毒颗粒,但这些病毒颗粒由于不能进一步感染正常细胞,从而不能进行第二轮复制,亦不会引起乳鼠死亡。用该质粒免疫20～40Kg重的猪能诱导产生中和抗体,并对猪形成一定的保护力。该DNA疫苗区别于传统DNA疫苗的地方在于由它编码的RNA能进行自我复制并产生多种抗原,与前面提到的Sindbis毒载体pSIN表达外源基因极为相似。
4 DNA分子佐剂增强DNA疫苗免疫效果
IL-2可作用于多种细胞,包括T、B淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞等,对免疫应答具有广泛的上调作用。1994年,Chow等[3]将IL-2应用于HBVDNA疫苗的研究中显示: 给小鼠肌肉注射1ug的PS2-S/PIL-2(S2-S表示HBV中蛋白)或pS2-S-IL-2得到的抗体滴度和CD4+T细胞增殖均相当于单独注射100ug的PS2-S。CD4+T细胞增殖均相当于单独注射100ug的pS2-S。当注射等量的各质粒时, 体外检测脾细胞分泌的各种细胞因子量,发现IL-2大幅度地加强了IFN-γ、IL-2的分泌,而对IL-4只有轻微的加强,说明IL-2主要是加强了机体的TH1型免疫应答。同时还发现IL-2有助于打破免疫耐受。Barouch等的研究结果却是,单独表达IL-2的质粒不能增强HIVgp120DNA疫苗诱发的免疫应答,只有表达IL-2/Ig融合蛋白的质粒才能明显地增强特异性抗体产生和T细胞增殖,而且这种增强效应必须在注射gp120DNA2天或5天后再注射IL-2/Ig表达质粒才有效,如果同时或提前注射则没有任何效应,甚至产生下调效应。Barouch等gp120蛋白本身就是一极强的抗原, 有可能同一细胞因子对编码不同抗原DNA疫苗的反应不一致。Kin等报告当把Gag/pol基因换为HIV的Env基因或Vif基因或Nef基因时,IL-12同样对CTL效应具明显增强作用,但对体液免疫应答则起抑制作用,表现为抗体滴度下降和B细胞减少。同样,Tsuji等也发现IL-12的表达质粒能加强HIVEnvDNA疫苗诱生的DTH和CTL效应, 同时使内源性的IFN-r大幅度上升,但对体液免疫则无任何显著影响。另外有报道说IL-12能够协助无任何免疫原性的流感病毒突变型核心蛋白DNA疫苗诱生强有力的CTL活性[4]。许多学者对IL-4、GM-CSF、免疫刺激调节分子CD154作了大量的研究发现：由Th2亚群产生IL-4，具有调节B细胞、T细胞、肥大细胞和巨噬细胞免疫作用。刺激B细的增殖，增强B细胞、巨噬细胞提呈抗原能力，使免疫系统对小量抗原刺激发生免疫应答[5]。IL-4增强IgG1和IgE表达水平，IL-4还可促进休止期B细胞的早期活化，从Go期进入G1期,细胞体积增大,并表达CD25。IL-4作为肿瘤免疫调节剂已进入Ⅱ期临床试验[6]。GM-CSF在免疫应答反应中,主要通过调节抗原递呈细胞的数量和功能来增强免疫应答强度。Geissler等[7]把表达GM-CSF的质粒与HCV核心抗原DNA疫苗共注射小鼠后,小鼠抗体阳转率比单独注射该疫苗高2倍。不仅如此,Cho等[8]还发现GM-CSF与抗原共质粒表达效果更好。Barouch等[9]则报道GM-CSF的佐剂效应在迟注射DNA疫苗后方可体现。免疫刺激调节分子CD154(即CD40Ligand)是T细胞上表达的CD40的配体,它与CD40的结合将刺激表达CD40分子的抗原提呈细胞增殖分化,并表达共刺激分子,从而放大抗原诱导的免疫应答。Mandoza等[10]将表达CD40L的质粒pCD40L和表达的质粒lacZ肌注或皮下免疫下鼠,发现pCD40L确实增强DNA疫苗诱导的体液及细胞免疫效应。除此之外，科研工作者还对其他分子佐剂如IL-5、6、7、18@@ ,B7-2等研究。
5．凋亡信号分子和泛素佐剂
当肌细胞、角化细胞等吸收了抗原DNA后，渐渐形成凋亡体，凋亡体被专职APC细胞识别吸收。在APC细胞正常清除凋亡小体时，抗原DNA继续表达。同时，APC细胞则通过免疫途径1将免疫信号提呈给CD8+T细胞。日本的Shin Sasaki等人将凋亡信号分子（Caspase1DNA）作简单的突变，减少细胞凋亡速度、延长凋亡时间，然后将此分子与红血球凝聚素（hemagglutinin）和淋巴细胞脉络丛脑炎病毒的核心蛋白(NP)DNA疫苗共表达。结果，显著地增加T细胞反应，但细胞免疫强于体液免疫。
细胞内源性蛋白的降解主要通过泛素途径。泛素是一种由76个氨基酸组成的蛋白质分子,其C端为—Gly。当要降解的底物蛋白被识别后,其Lys与泛素末位Gly共价结合,其它泛素分子的Gly再顺次结合到前一分子的Lys上,形成多聚泛素--底物蛋白复合物,该复合物最终将被蛋白酶体降解。最近,Rodriguez等利用此降解途径,将淋巴细胞脉络丛脑炎病毒的核心蛋白(NP)与泛素蛋白(Ub)融合表达,Ub稍作改动,即将末位的Gly改为Ala,以防止融合蛋白降解为NP和Ub单体。结果,这种泛素化的抗原快速的被降解。NP在胞内的加速降解使得它不能诱导产生体液免疫,但却提高了它被MHC-1类分子识别提呈的机率,从而大大提高了CTL活性和对小鼠的保护效率。Rodriguez用泛素化NP基因免疫的8只小鼠(BALB/C及C57BL/6各4只)在第6周攻毒后全部存活,并且在脾内检测不到L-CMV;而同期未泛素化的NP基因只产生了75%的保护率。这是迄今为止免疫效果最好的DNA疫苗。
6 结语
迄今为止,对于大部分的DNA疫苗的免疫作用,只有在激发机体产生TH1型免疫应答后才能够有效的产生强有力的细胞毒性T细胞的杀伤效应，而对于DNA不育疫苗诱导TH2型免疫应答，激发高效价的IgG就显非常必要的。为此,选择适当的佐剂、载体诱导疫苗的免疫应答分型及加强免疫原性具有非常重要意义,从上述中各种增强DNA疫苗的免疫效应途径来看,学者们探讨了包括上述的载体的品质及各种分子佐剂、佐剂蛋白表达启动子及佐剂添加部位、时相、剂量等促施增强DNA疫苗的免疫效应,虽然到目前为止增强DNA免疫所得到的结果还很不均一。但由于以质粒为载体的细胞因子与其他佐剂相比,它具有许多特有的优点:如，一次少量给予即可维持长时低量表达又不会产生副作用,且无需再频繁连续补给;制备简单成本廉等；尤其是对免疫共刺激分子及免疫刺激调节分子等分子佐剂与DNA疫苗的共同研究将有助于对免疫机制的了解。一旦能得到了各种佐剂确定的影响效应,将会很有助于DNA疫苗的优化,增强其实用性。同时,这些佐剂也可能用于其它类型的疫苗,发挥同样的优化作用。所以,分子佐剂向人们展示了乐观的应用前景, 随着DNA疫苗免疫机制深入的研究及效果的确定,DNA疫苗的免疫原性将发挥广泛作用，达到对其进行人为的调节控制,扬长避短,开辟疫苗领域的新天地。
