【旧贴整理】SSCP检测SNP原理,步骤及常见问题总结整理
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SSCP原理:sscp称为单链构象多态性,它是基于DNA构象来检测PCR产物单链碱基微小差异的方法,因其检测敏感,快速和所需装置简便而在分子生物学各个领域广泛应用。但该方法的试验结果受多种因素的影响,如:PCR产物,温度,电压,PAGE胶的浓度和交联度等,因而重复性比较差。因此在做SSCP时要注意各种条件的一致性。如果有酶切位点的话最好用RFLP方法检测DNA 多态,或是用SSCP与RFLP两种方法相结合,试验结果要更加可靠些。
SSCP的主要试验步骤:
1. PCR扩增目的基因片段。
2. 制备PAGE(聚丙烯酰胺)胶。不同长度的基因片段用不同浓度和交联度的胶,常用 的有19:1,29:1,39:1(丙烯酰胺:甲叉),浓度有8%,10%,12%的。
3. PAGE胶的灌制。将配好的PAGE胶混匀,立即灌至干净的玻璃板中,插上梳子于室温聚合1-2小时。
4. PCR产物的变性及电泳。取1-2ulPCR产物加5ul变性缓冲液,95度水浴或放置PCR仪上变性10分钟,立即拿出冰浴,迅速上样于非变性的PAGE胶,以1×TBE作缓冲液,在一定温度下电泳。根据待测片段的长度调整电压和电泳时间。
5. PAGE胶的染色。一般采用银染的方法,具体方法很多,查查作这方面的文章就知道了。基本上包括染色,显色,停显及观察结果(判型)几个步骤。
其中比较重要的是PAGE胶的交联度和浓度的选择,这要通过反复的试验进行比较,从而选择最佳条件。另外温度也要控制好,有的说要最好在4度冰箱中跑电泳,但我们实验室的基本都是在室温条件下跑电泳,结果也还可以。
一些参考数据
1、电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象,SSCP应在较低温 度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外,电压过高也是引起温度升高的主要原因,因此,在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时,开始的5min应用较高的电压(250V),以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离,而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.
2、靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高,这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下DNA的长度不会影响SSCP 的效果.他们仔细选择了实验条件,发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上。
因为目的片段越长其单链的泳动速度越慢,大于400bp的目的片断不但检出率低而且泳动速度极慢,所以建议楼主不要做sscp为好。
我们实验室的步骤如下(在以上主要试验步骤做修改):
pcr产物好了后,按1:1各10ul得产物和变性上样液,在pcr仪上95度变性5分钟,要立即骤冷(准备好的冰浴)10分钟,加样。恒功率20W,我们的槽子是25cm的伯乐!一般200bp,恒温7度,5各小时就好了。(注意pcr产物一定要好,和maker中最亮的一样!)
我们试验室做SNP用的是如下仪器:
1。PTC-200的PCR仪(扩增、变性都用他)
2。水平电泳槽(鉴定PCR产物)
3。BIO-RAD universal mutation detection system 垂直电泳槽(变性后的产物检测)
4。恒温水域器(保持电泳的温度在4-6度)
5。凝胶成像系统(GENE公司)
以上就是我们试验的做SNP的仪器,别的小的仪器就不一一说明了。
说明一下优缺点:
1。变性,我们是95度10分钟,和做PCR扩增一样。用PCR仪可以保证温度、时间的准确。如果用水域锅,就要防止体系的挥发和变性温度的准确。
2。做SNP一定要保证PCR产物的浓度好,所以当然用琼脂糖鉴定了。如果浓度够,在变性鉴定时,单链浓度就更小,将导致无法鉴定!
3。恒温,做SNP要保持电泳槽恒温,一般在4-6度。如果温度高,对鉴定有影响。如温度高,条带跑的快,无法达到预期的单链和双链分开!
这里在强调一下,如果有双链无单链的情况下变性后的PCR产物一定要保证骤冷,防止复性,增加单链的浓度!以上是我做SNP的经验,请大家指正!
1.SSCP的原理:
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=761629&sty=3&keywords=sscp%D4%AD%C0%ED
http://www.dxy.cn/bbs/thread/1831111
2.SSCP染色
http://www.dxy.cn/bbs/thread/8353511
3.SSCP的相关资料
http://www.dxy.cn/bbs/thread/1831111
4.SSCP的具体试验步骤
http://www.dxy.cn/bbs/thread/1831147
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=529851&sty=3&keywords=sscp+%B2%BD%D6%E8
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=1292795&sty=3&keywords=sscp+%B2%BD%D6%E8
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/6165571_1.html (哈尔滨医科大学课件)
5.SSCP参考文献
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/71620_0.html
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/71621_0.html
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/71627_0.html
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=1831226&sty=3&keywords=sscp+%CE%C4%CF%D7
http://www.dxy.cn/bbs/thread/1831238
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/71627_0.html
6.SSCP的图片
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=732382&sty=3&keywords=sscp
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=884801&sty=3&keywords=sscp+%CD%BC (求助)
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=758701&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp (求助)
7.PCR-SSCP、 RTPCR-SSCP差别
http://www.dxy.cn/bbs/thread/535026
8.实验中一些问题和解答
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/186112_0.html
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=568985&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=606798&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=884801&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3477892_1.html
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=601825&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=659536&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=735350&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp
SSCP的主要试验步骤:
1. PCR扩增目的基因片段。
2. 制备PAGE(聚丙烯酰胺)胶。不同长度的基因片段用不同浓度和交联度的胶,常用 的有19:1,29:1,39:1(丙烯酰胺:甲叉),浓度有8%,10%,12%的。
3. PAGE胶的灌制。将配好的PAGE胶混匀,立即灌至干净的玻璃板中,插上梳子于室温聚合1-2小时。
4. PCR产物的变性及电泳。取1-2ulPCR产物加5ul变性缓冲液,95度水浴或放置PCR仪上变性10分钟,立即拿出冰浴,迅速上样于非变性的PAGE胶,以1×TBE作缓冲液,在一定温度下电泳。根据待测片段的长度调整电压和电泳时间。
5. PAGE胶的染色。一般采用银染的方法,具体方法很多,查查作这方面的文章就知道了。基本上包括染色,显色,停显及观察结果(判型)几个步骤。
其中比较重要的是PAGE胶的交联度和浓度的选择,这要通过反复的试验进行比较,从而选择最佳条件。另外温度也要控制好,有的说要最好在4度冰箱中跑电泳,但我们实验室的基本都是在室温条件下跑电泳,结果也还可以。
一些参考数据
1、电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象,SSCP应在较低温 度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外,电压过高也是引起温度升高的主要原因,因此,在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时,开始的5min应用较高的电压(250V),以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离,而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.
2、靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高,这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下DNA的长度不会影响SSCP 的效果.他们仔细选择了实验条件,发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上。
因为目的片段越长其单链的泳动速度越慢,大于400bp的目的片断不但检出率低而且泳动速度极慢,所以建议楼主不要做sscp为好。
我们实验室的步骤如下(在以上主要试验步骤做修改):
pcr产物好了后,按1:1各10ul得产物和变性上样液,在pcr仪上95度变性5分钟,要立即骤冷(准备好的冰浴)10分钟,加样。恒功率20W,我们的槽子是25cm的伯乐!一般200bp,恒温7度,5各小时就好了。(注意pcr产物一定要好,和maker中最亮的一样!)
我们试验室做SNP用的是如下仪器:
1。PTC-200的PCR仪(扩增、变性都用他)
2。水平电泳槽(鉴定PCR产物)
3。BIO-RAD universal mutation detection system 垂直电泳槽(变性后的产物检测)
4。恒温水域器(保持电泳的温度在4-6度)
5。凝胶成像系统(GENE公司)
以上就是我们试验的做SNP的仪器,别的小的仪器就不一一说明了。
说明一下优缺点:
1。变性,我们是95度10分钟,和做PCR扩增一样。用PCR仪可以保证温度、时间的准确。如果用水域锅,就要防止体系的挥发和变性温度的准确。
2。做SNP一定要保证PCR产物的浓度好,所以当然用琼脂糖鉴定了。如果浓度够,在变性鉴定时,单链浓度就更小,将导致无法鉴定!
3。恒温,做SNP要保持电泳槽恒温,一般在4-6度。如果温度高,对鉴定有影响。如温度高,条带跑的快,无法达到预期的单链和双链分开!
这里在强调一下,如果有双链无单链的情况下变性后的PCR产物一定要保证骤冷,防止复性,增加单链的浓度!以上是我做SNP的经验,请大家指正!
1.SSCP的原理:
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=761629&sty=3&keywords=sscp%D4%AD%C0%ED
http://www.dxy.cn/bbs/thread/1831111
2.SSCP染色
http://www.dxy.cn/bbs/thread/8353511
3.SSCP的相关资料
http://www.dxy.cn/bbs/thread/1831111
4.SSCP的具体试验步骤
http://www.dxy.cn/bbs/thread/1831147
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=529851&sty=3&keywords=sscp+%B2%BD%D6%E8
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=1292795&sty=3&keywords=sscp+%B2%BD%D6%E8
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/6165571_1.html (哈尔滨医科大学课件)
5.SSCP参考文献
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/71620_0.html
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/71621_0.html
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/71627_0.html
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=1831226&sty=3&keywords=sscp+%CE%C4%CF%D7
http://www.dxy.cn/bbs/thread/1831238
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/71627_0.html
6.SSCP的图片
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=732382&sty=3&keywords=sscp
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=884801&sty=3&keywords=sscp+%CD%BC (求助)
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=758701&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp (求助)
7.PCR-SSCP、 RTPCR-SSCP差别
http://www.dxy.cn/bbs/thread/535026
8.实验中一些问题和解答
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/186112_0.html
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=568985&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=606798&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=884801&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3477892_1.html
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=601825&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=659536&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=735350&sty=3&keywords=%C7%F3%D6%FA+sscp