关于real time pcr 的点滴思考和困难。
丁香园
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我正在做用SYBR GREEN I做荧光染料的实时定量PCR，遇到的问题不少，同时也有点心得，借些平台和各位站友交流，望各位给以指证和帮助。
首先，主要的问题是反应效率低下：我用10-1 ～10-9 的浓度梯度的反转录产物作为模板，预设它们的浓度是1×10-1 ～10-9 ，结果作出的各个模板浓度对应的CT值与理论完全相反，即：浓度越小，反应曲线就越快地起峰，就是CT值越小。作溶解曲线有时单峰，有时是双峰。BIO-RAD的ICYCLER软件作出来的标准曲线的斜率大多是正值，也有时是负值，但负值也就是负的零点几，好的时候最多是-1.180，开始疑是两步法的反应效率低，于是改用三步法，反应效率有所提高，即中间浓度的样本10-4 ～10-7 等的CT值与理论相符合，浓度高的，CT值小，但别一个问题也随之出现：溶解曲线往往出现两个峰，提示有杂带产生。而且还有一个很奇怪的现象，就是我的空白对照（未加模板）也出现明显的反应S形扩增曲线。
现在分析，开始用两步法时出现的模板浓度越小，反应曲线就越快地起峰，就是CT值越小的现象的可能原因是：针对模板的反应效率低下，引物二聚体形成的效率反而随模板浓度的梯度下降而竞争性增高，空白对照也可以出现反应扩增曲线可以作为佐证。后来做的行普通温度梯度PCR再电泳时也发现：目的基因条带越弱，跑在目的条带之前的杂带（应该是引物二聚体）就越强。在那种情况下形成的单峰溶解曲线也很可能只是引物二聚体的溶解曲线，而没有或几乎没有目的基因溶解产生的峰。
改用三步法之后，部分模板浓度的样品反应扩增曲线的CT值基本符合模板浓度越大，CT值越小的理论。但空白对照仍然出现S形反应曲线，溶解曲线可有双峰，一个在82度左右，另一个峰在90左右，现在想起，90度左右的溶解曲线峰才是目的基因的峰，82度左右的溶解峰是引物二聚体。这个想法可以用以下的图来说明：
图中的反应扩增曲线从A2到A9分别代表模板浓度从1×10-1 ～10-9 ，
这是该反应的溶解曲线，90度左右的峰应该是目的基因，82度左右的是在模板浓度很低的情况下，引物二聚体形成的杂带解离而形成的峰。
用icycler分析软件减去样本浓度较低的样本A6～A10（1×10-5 ～10-9）以及空白对照，（这些样本是产生的扩增曲线主要是因为引物二聚体，基本上没有目的条带的产生），排除这些干扰之后，再用软件分析，得到如图：
1×10-1 ～10-4 模板浓度的样本的CT值和理论浓度越大，CT值越小相符。
由此得出的标准曲线相关系数是0.979，斜率-2.008，样本的反应效率还是比较高的，虽然和理想值（-3.2左右）还相差很远。
下图是去掉干扰样本之后软件重绘的溶解曲线可以看出，1×10-1 ～10-4 模板浓度的样本还是形成了引物二聚体，尤其是A5，这也可以成为标准曲线的斜率和理想值相差还很远的原因之一。溶解曲线成峰之前形成波浪线，这也是反应有非特异性扩增等干扰因素的表现。
由此可以得出：
1. 该样本的稀释梯度以原液到10-4 宜，过度释释反应效率极低。
2. 过度释释的模板及模板空白对照均有引物二聚体产生，应该考虑引物，引物浓度，退火温度及退火延伸时间等因素。
留个e-mail,盼望得到指教。
注：因为有图 不知道怎么样放上去，我把带图的WORD文档上传，请高手指点。
首先，主要的问题是反应效率低下：我用10-1 ～10-9 的浓度梯度的反转录产物作为模板，预设它们的浓度是1×10-1 ～10-9 ，结果作出的各个模板浓度对应的CT值与理论完全相反，即：浓度越小，反应曲线就越快地起峰，就是CT值越小。作溶解曲线有时单峰，有时是双峰。BIO-RAD的ICYCLER软件作出来的标准曲线的斜率大多是正值，也有时是负值，但负值也就是负的零点几，好的时候最多是-1.180，开始疑是两步法的反应效率低，于是改用三步法，反应效率有所提高，即中间浓度的样本10-4 ～10-7 等的CT值与理论相符合，浓度高的，CT值小，但别一个问题也随之出现：溶解曲线往往出现两个峰，提示有杂带产生。而且还有一个很奇怪的现象，就是我的空白对照（未加模板）也出现明显的反应S形扩增曲线。
现在分析，开始用两步法时出现的模板浓度越小，反应曲线就越快地起峰，就是CT值越小的现象的可能原因是：针对模板的反应效率低下，引物二聚体形成的效率反而随模板浓度的梯度下降而竞争性增高，空白对照也可以出现反应扩增曲线可以作为佐证。后来做的行普通温度梯度PCR再电泳时也发现：目的基因条带越弱，跑在目的条带之前的杂带（应该是引物二聚体）就越强。在那种情况下形成的单峰溶解曲线也很可能只是引物二聚体的溶解曲线，而没有或几乎没有目的基因溶解产生的峰。
改用三步法之后，部分模板浓度的样品反应扩增曲线的CT值基本符合模板浓度越大，CT值越小的理论。但空白对照仍然出现S形反应曲线，溶解曲线可有双峰，一个在82度左右，另一个峰在90左右，现在想起，90度左右的溶解曲线峰才是目的基因的峰，82度左右的溶解峰是引物二聚体。这个想法可以用以下的图来说明：
图中的反应扩增曲线从A2到A9分别代表模板浓度从1×10-1 ～10-9 ，
这是该反应的溶解曲线，90度左右的峰应该是目的基因，82度左右的是在模板浓度很低的情况下，引物二聚体形成的杂带解离而形成的峰。
用icycler分析软件减去样本浓度较低的样本A6～A10（1×10-5 ～10-9）以及空白对照，（这些样本是产生的扩增曲线主要是因为引物二聚体，基本上没有目的条带的产生），排除这些干扰之后，再用软件分析，得到如图：
1×10-1 ～10-4 模板浓度的样本的CT值和理论浓度越大，CT值越小相符。
由此得出的标准曲线相关系数是0.979，斜率-2.008，样本的反应效率还是比较高的，虽然和理想值（-3.2左右）还相差很远。
下图是去掉干扰样本之后软件重绘的溶解曲线可以看出，1×10-1 ～10-4 模板浓度的样本还是形成了引物二聚体，尤其是A5，这也可以成为标准曲线的斜率和理想值相差还很远的原因之一。溶解曲线成峰之前形成波浪线，这也是反应有非特异性扩增等干扰因素的表现。
由此可以得出：
1. 该样本的稀释梯度以原液到10-4 宜，过度释释反应效率极低。
2. 过度释释的模板及模板空白对照均有引物二聚体产生，应该考虑引物，引物浓度，退火温度及退火延伸时间等因素。
留个e-mail,盼望得到指教。
注：因为有图 不知道怎么样放上去，我把带图的WORD文档上传，请高手指点。
