提高PCR阳性率的策略
丁香园论坛
2637
各位老师好，我是论坛新手，请多关照。本人在中华检验杂志写了一篇关于提高PCR阳性率方法的小文章。贴上，望大家指正、批评。
提高乙型肝炎病毒P基因区聚合酶链反应检测阳性率的策略
徐文胜 张瑞祺 缪晓辉 郝 勇 吴文雅
目前许多抗乙型肝炎病毒药物是通过抑制HBV DNA多聚酶活性而达到抗病毒效果。然而病毒在药物选择压力下会发生基因突变，而获得对药物的抗性。测序是判断病毒碱基突变最直接和最可靠的方法，但在作序列分析之前必须采用聚合酶链反应（PCR）获得目的基因。由于HBV DNA的P基因区是高突变区，在实际PCR检测中容易出现假阴性结果。因此，提高多变区基因PCR的检测阳性率，是了解病毒变异情况的前提。本研究综合采用优化PCR反应条件，选择最佳引物，降低退火温度以及应用3’末端碱基游移兼并引物等多种方法提高了HBV DNA P基因区PCR检测阳性率。
材料与方法
一、材料
1．血清标本：本科血清库冻存82份HBsAg和HBeAg以及HBV DNA均阳性血清标本，分别经ELISA法及微反应板酶联杂交法[1]证实。4份血清标本分别取自4例确诊为慢性乙型病毒性肝炎（轻～中度）、经拉米夫定治疗（100mg、每日一次）一年后，症状复发，血清丙氨酸转移酶（ALT）水平再度升高的病人。血清标本亦经微反应板酶联杂交检测法证实HBV DNA阳性，编号为A、B、C、D。
2．试剂和仪器：Taq DNA聚合酶购自Sangon公司；DNA纯化试剂盒为上海华舜公司产品；四种dNTP购自上海华美公司。9700型PCR扩增仪为美国ABI公司产品。四星图象处理系统购自上海四星生物技术实业有限公司。
3．HBV DNA质粒：pADR-1 DNA，由adr亚型HBV全基因组经BamH Ⅰ酶切后，克隆至pBR322载体，本科保存。
二、方法
1．引物Y1和Y2设计：在adr亚型HBV基因组P区基因内（2147~3006位），用寡核苷酸设计软件（HYBsimulator Version 4.0）设计两对PCR引物Y1和Y2，扩增片段长度分别为321bp及282bp；两个扩增片段均含有编码YMDD基序的基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。第一对引物（Y1）：上游引物（Y1U）5’-CCTCTATGTTTCCCTCTTGTTG-3’，下游引物（Y1D）5’-GAATAGCCCCAACGTTT
GG-3’。第二对引物（Y2）：上游引物（Y2U）5’-TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG-3’，下游引物（Y2D）5’－GGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG－3’。
2．3′末端游移引物设计：将Y2U、Y2D 3′末端分别减去1个或2个碱基，同时根据模板序列应用HYBsimulator Version 4.0软件，于引物5′末端增加1至数个碱基，使得所设计突变引物（3′末端游移引物）的Tm值、发夹结构和形成二聚体能量值等引物参数与Y2尽量相同。突变上游引物1（J1U）：在Y2U 3′末端减去1个碱基G，于5′端加上T；突变上游引物2（J2U）：在Y2U 3′末端减去2个碱基GG，于5′端加上GGAT。突变下游引物1（J1D）：在Y2D 3′末端减去1个碱基G，于5′端加上C，；突变下游引物2（J2D）： 在Y2D 3′末端减去2个碱基C G，于5′端加上C。
3．PCR条件的优化：以HBV DNA质粒为模板，采用距阵法，将Y1和Y2两对引物在PCR中Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物退火温度进行优化。Y1和Y2在Taq酶1.0U、Mg2+ 3mM、退火温度53℃时能获得最佳扩增效率，同时原料消耗最少。因此Y1、Y2的PCR条件最终确定为：采用直接煮沸法抽提血清HBV DNA；模板上样量5μl，10×PCR缓冲液5μl，MgCl2（25mmol/L）3μl，4×dNTP（10mmol/L）1μl，上、下游引物各12.5pmol，Taq DNA聚合酶1U，用去离子水补充至总体积50μl；PCR反应过程：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸45秒，共38循环；72℃再延伸5分钟。
4．引物的选择：将82份阳性血清标本，根据参考文献[2]采用直接煮沸法抽提血清HBV DNA。按方法3，分别用Y1、Y2两对引物进行扩增。扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下观察结果；比较二者扩增阳性率，选择阳性率高的引物进行以下试验。
5．进一步提高检测阳性率的方法：（1）降低引物退火温度：选取优化的PCR条件下Y2引物扩增阴性的血清标本15份，用Y2引物再作PCR，但对引物退火温度分别适当降低3℃及5℃，其余同方法3。（2）减少3’末端错配对PCR的影响：将Y2引物和J1U、J2U、J1D、J2D 4条突变引物混合后构成兼并引物，每条引物各5pmol，按方法3扩增上述15份Y2引物扩增阴性的血清标本。分别采用Y2引物和兼并引物对4例拉米夫定治疗后病人血清标本抽提物按方法3进行PCR。（3）比较Y1、Y2扩增阳性标本，观察在Y2扩增阴性标本中Y1扩增的阳性数。
6．序列分析：所有PCR扩增产物都经2%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙啶染色后，紫外灯下观察结果，切割含阳性条带的凝胶，柱纯化法抽提目的DNA。纯化产物由上海生工生物工程有限公司进行序列分析。测序引物为各自上游引物。
7．统计分析：检测阳性率采用χ2检验，显著性界值为P < 0.05。
结 果
1．两对引物扩增效率：Y2阳性率81.7%(67/82)，而Y1阳性率仅为67.1%(55/82)。二者阳性率比较相差显著（P < 0.05）。选定Y2为以后试验的扩增引物。
2．15份Y2扩增阴性标本在退火温度降低3℃后能得到2份标本检测阳性，其测序结果见表1，标本5、11在引物结合区内存在碱基突变，突变碱基为2~5个。而降低5℃时，琼脂糖电泳不能得到特异的阳性条带。15份Y2扩增阴性标本中有1份Y1扩增阳性。
表1 降低退火温度3℃后扩增产物测序结果
上游引物区 YMDD编码区 下游引物区
野生株 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT TCGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本5 TTATTCAGTGTTTCGTAGGG TATATTGATGAT TCGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本11 TTGTTGTGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT TCGAAGACTACCTGTAACGAGACCG
注：黑体字下划线为突变碱基位点
3．3′末端错配对PCR的影响：15份Y2扩增阴性标本，用兼并引物作PCR后有7份标本检测阳性，其测序结果见表2，7份标本在引物结合区3′末端均可见碱基突变。4份拉米夫定治疗后复发病人的血清标本用Y2引物扩增结果均为阴性，而用兼并引物扩增4份血清标本有2例发生YMDD变异（为YIDD或YVDD变异）。同时，在每份标本的被检基因片段的上游或下游引物3’末端结合区发生了变异。序列测序结果见表3。
综合结果2和结果3，通过降低退火温度及减少3′末端错配的方法使PCR检测阳性率由81.7%(67/82)增加至92.7%(76/82)，二者比较相差显著（P < 0.05）。
表2 兼并引物扩增产物测序结果
上游引物区 YMDD编码区 下游引物区
野生株 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT CGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本1 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT AGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本4 TTTGTTCAGTGGTTCGTAGGC TATATTGATGAT CGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本6 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT AGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本7 TTTGTTCAGTGGTTCGTAGGC TATATTGATGAT GGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本12 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT GTAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本13 TTGTTCAGTGGTTCGTAGCA TATATGGATGAT CGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本14 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT TGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
注：黑体字下划线为突变碱基位点
表3 兼并引物扩增4例拉米呋丁治疗无效病人血清PCR产物测序结果
上游引物结合区 YMDD编码区 下游引物结合区
病人A TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT TAGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
病人B TTTGTTCAGTGGTTCGTAGGC TATATTGATGAT TCGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
病人C TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT TGTAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
病人D TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATTGATAAT TAGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
注：黑体字下划线为突变碱基位点
讨 论
长期以来，人们较多地注意了PCR的假阳性对检测的影响，而对PCR假阴性问题认识不足。有许多因素可能造成假阴性结果，如标本的抽提方法、试剂质量、反应体系、引物选择等等。要成功地得到靶序列的扩增，PCR要求模板、引物、dNTP、DNA聚合酶和缓冲液之间的无数复杂相互作用。尽管套式/半套式PCR能提高微量核酸标本检测阳性率，但标本的核酸抽提得率是保证PCR获得阳性结果的基础，我们以往的试验[2]发现经典的酚—氯仿抽提法的抽提得率较低，而血清直接煮沸法能获得较高的得率。另外碱裂解法[3]及商品化的核酸抽提试剂盒也推荐使用。不同的试验室有不同的试验条件和环境，因此对于每个试验室，任何一项PCR都必须优化，而不能仅仅根据经验或推荐的反应条件进行，PCR条件的优化是提高检测阳性率必不可少的步骤。
引物的选择很关键，通常根据目的基因的保守区域设计引物，以减少因目的基因碱基突变导致的引物错配而出现假阴性结果。由于HBV DNA P基因区是核酸多变区，可能因为目的基因引物结合区的碱基突变，引物与模板碱基发生错配导致PCR假阴性结果，因此有必要设计多对引物并对引物进行选择。引物与模板碱基的错配包括3′末端和内部的错配，任何错配都会影响PCR的效率，并且3′末端的错配比内部的错配对PCR的损害更大[4]。本试验发现15例Y2扩增阴性标本中有9例为模板引物结合区发生突变所致。虽然，有研究者[5-7]认为PCR对3′末端的错配有一定的容许度，特别是通过设计带有3’末端T的引物可以使检测的假阴性降到最小，但要求对整个PCR反应系统作繁琐的优化以顺应错配。我们采用了3′末端碱基游移兼并引物，即在最初设计的引物基础上将引物3′末端碱基减少1～2个碱基，同时应用引物设计软件使突变引物的各项参数尽量与原来保持一致。由于引物参数基本相同，它们可以在同一PCR反应管内扩增相同模板，而几乎不影响扩增效率。本方法不仅提高了检测的阳性率，还简化了操作的繁琐性。另外，研究者们[8-11]还采取了许多策略以顺应错配，如使用至少25个碱基的引物（Tm > 70℃），高的dNTP浓度以及更低的退火温度等。我们也曾重复类似工作，将Y2引物加长至30个碱基，但它失去了引物本身应该具备的参数条件，不能扩增出目的片段。把引物的退火温度下降5℃，虽然在琼脂糖电泳中可以见到阳性条带，但是非特异性扩增片段过多，不能测序。而降低3℃的退火温度，可以使引物结合区内部的错配的影响减少到最小，从而使检测的阳性率增加。
PCR技术的应用极大地提高了检测的灵敏度，但仍受到许多因素的制约，特别对于象HBV DNA P基因区的核酸多变区，应综合采用优化PCR反应条件，选择引物，降低退火温度以及应用3′末端碱基游移兼并引物等方法可提高基因高突变区PCR检测阳性率。
参 考 文 献
1 缪晓辉,孔宪涛,戚中田. 微反应板酶联夹心杂交定量检测乙型肝炎病毒基因组.中华传染病杂志,2000,18:40-42.
2 徐文胜,缪晓辉,潘怡,等. 不同方法抽提血清HBV DNA得率的比较.肝脏,2001,6:218-220.
3 Urdea MS, Running JA, Horn T, et al. A novel method for the rapid detection of specific nucleotide sequence in crude biological samples without blotting or radioactivity: application to the analysis of hepatitis B virus in human serum. Gene, 1987,61:253-264.
4 黄培堂,俞炜源,陈添弥,等译. .PCR技术试验指南.北京:科学出版社,1998.96.
5 Kwok S, Kellogg D, Mckinney N, et al. Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies. Nucleic Acids Res, 1990, 18: 999-1005.
6 Li H, Cui X, Arnheim N. Direct electrophoretic detection of the alleic state of single DNA molecules in human sperm by using the polymerase chain reaction. Proc Nat. Acad Sci USA, 1990, 87:4580-4584.
7 Huang M, Arnheim N, Goodman MF.. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: Implications for single nucleotide discremination in PCR. Nucleic Acids Res, 1992, 20: 4567-4573.
8 Hoheisel JD., Craig AG., Lehrach H. Effect of 5-bromo-and 5-methyldeoxycytosine on duples stability and discrimiantion of the NotI octadeoxynucleotide. Quantitative measurement using thin-layer chromatograph. J Biol Chem, 1990, 265:16656-16660.
9 Nichols R, Andrews PC, Zhang P. et al. A universal nucleoside for use at ambiguous sites in DNA primers. Nature, 1994,369:492-493.
10 Ayyadevara S, Thaden JJ, Shmookler Reis RJ. Discrimination of primer 3’-nucleotide mismatch by Taq DNA polymerase during polymerase chain reaction. Source Anal Biochem, 2000, 284: 11-18.
11 Tipples GA., Ma MM., Fischer KP. et al. Mutation in HBV RNA-dependent DNA Polymerase confers resistance to lamivudine in vivo. Hepatology, 1996, 24:714-717.
提高乙型肝炎病毒P基因区聚合酶链反应检测阳性率的策略
徐文胜 张瑞祺 缪晓辉 郝 勇 吴文雅
目前许多抗乙型肝炎病毒药物是通过抑制HBV DNA多聚酶活性而达到抗病毒效果。然而病毒在药物选择压力下会发生基因突变，而获得对药物的抗性。测序是判断病毒碱基突变最直接和最可靠的方法，但在作序列分析之前必须采用聚合酶链反应（PCR）获得目的基因。由于HBV DNA的P基因区是高突变区，在实际PCR检测中容易出现假阴性结果。因此，提高多变区基因PCR的检测阳性率，是了解病毒变异情况的前提。本研究综合采用优化PCR反应条件，选择最佳引物，降低退火温度以及应用3’末端碱基游移兼并引物等多种方法提高了HBV DNA P基因区PCR检测阳性率。
材料与方法
一、材料
1．血清标本：本科血清库冻存82份HBsAg和HBeAg以及HBV DNA均阳性血清标本，分别经ELISA法及微反应板酶联杂交法[1]证实。4份血清标本分别取自4例确诊为慢性乙型病毒性肝炎（轻～中度）、经拉米夫定治疗（100mg、每日一次）一年后，症状复发，血清丙氨酸转移酶（ALT）水平再度升高的病人。血清标本亦经微反应板酶联杂交检测法证实HBV DNA阳性，编号为A、B、C、D。
2．试剂和仪器：Taq DNA聚合酶购自Sangon公司；DNA纯化试剂盒为上海华舜公司产品；四种dNTP购自上海华美公司。9700型PCR扩增仪为美国ABI公司产品。四星图象处理系统购自上海四星生物技术实业有限公司。
3．HBV DNA质粒：pADR-1 DNA，由adr亚型HBV全基因组经BamH Ⅰ酶切后，克隆至pBR322载体，本科保存。
二、方法
1．引物Y1和Y2设计：在adr亚型HBV基因组P区基因内（2147~3006位），用寡核苷酸设计软件（HYBsimulator Version 4.0）设计两对PCR引物Y1和Y2，扩增片段长度分别为321bp及282bp；两个扩增片段均含有编码YMDD基序的基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。第一对引物（Y1）：上游引物（Y1U）5’-CCTCTATGTTTCCCTCTTGTTG-3’，下游引物（Y1D）5’-GAATAGCCCCAACGTTT
GG-3’。第二对引物（Y2）：上游引物（Y2U）5’-TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG-3’，下游引物（Y2D）5’－GGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG－3’。
2．3′末端游移引物设计：将Y2U、Y2D 3′末端分别减去1个或2个碱基，同时根据模板序列应用HYBsimulator Version 4.0软件，于引物5′末端增加1至数个碱基，使得所设计突变引物（3′末端游移引物）的Tm值、发夹结构和形成二聚体能量值等引物参数与Y2尽量相同。突变上游引物1（J1U）：在Y2U 3′末端减去1个碱基G，于5′端加上T；突变上游引物2（J2U）：在Y2U 3′末端减去2个碱基GG，于5′端加上GGAT。突变下游引物1（J1D）：在Y2D 3′末端减去1个碱基G，于5′端加上C，；突变下游引物2（J2D）： 在Y2D 3′末端减去2个碱基C G，于5′端加上C。
3．PCR条件的优化：以HBV DNA质粒为模板，采用距阵法，将Y1和Y2两对引物在PCR中Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物退火温度进行优化。Y1和Y2在Taq酶1.0U、Mg2+ 3mM、退火温度53℃时能获得最佳扩增效率，同时原料消耗最少。因此Y1、Y2的PCR条件最终确定为：采用直接煮沸法抽提血清HBV DNA；模板上样量5μl，10×PCR缓冲液5μl，MgCl2（25mmol/L）3μl，4×dNTP（10mmol/L）1μl，上、下游引物各12.5pmol，Taq DNA聚合酶1U，用去离子水补充至总体积50μl；PCR反应过程：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸45秒，共38循环；72℃再延伸5分钟。
4．引物的选择：将82份阳性血清标本，根据参考文献[2]采用直接煮沸法抽提血清HBV DNA。按方法3，分别用Y1、Y2两对引物进行扩增。扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下观察结果；比较二者扩增阳性率，选择阳性率高的引物进行以下试验。
5．进一步提高检测阳性率的方法：（1）降低引物退火温度：选取优化的PCR条件下Y2引物扩增阴性的血清标本15份，用Y2引物再作PCR，但对引物退火温度分别适当降低3℃及5℃，其余同方法3。（2）减少3’末端错配对PCR的影响：将Y2引物和J1U、J2U、J1D、J2D 4条突变引物混合后构成兼并引物，每条引物各5pmol，按方法3扩增上述15份Y2引物扩增阴性的血清标本。分别采用Y2引物和兼并引物对4例拉米夫定治疗后病人血清标本抽提物按方法3进行PCR。（3）比较Y1、Y2扩增阳性标本，观察在Y2扩增阴性标本中Y1扩增的阳性数。
6．序列分析：所有PCR扩增产物都经2%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙啶染色后，紫外灯下观察结果，切割含阳性条带的凝胶，柱纯化法抽提目的DNA。纯化产物由上海生工生物工程有限公司进行序列分析。测序引物为各自上游引物。
7．统计分析：检测阳性率采用χ2检验，显著性界值为P < 0.05。
结 果
1．两对引物扩增效率：Y2阳性率81.7%(67/82)，而Y1阳性率仅为67.1%(55/82)。二者阳性率比较相差显著（P < 0.05）。选定Y2为以后试验的扩增引物。
2．15份Y2扩增阴性标本在退火温度降低3℃后能得到2份标本检测阳性，其测序结果见表1，标本5、11在引物结合区内存在碱基突变，突变碱基为2~5个。而降低5℃时，琼脂糖电泳不能得到特异的阳性条带。15份Y2扩增阴性标本中有1份Y1扩增阳性。
表1 降低退火温度3℃后扩增产物测序结果
上游引物区 YMDD编码区 下游引物区
野生株 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT TCGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本5 TTATTCAGTGTTTCGTAGGG TATATTGATGAT TCGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本11 TTGTTGTGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT TCGAAGACTACCTGTAACGAGACCG
注：黑体字下划线为突变碱基位点
3．3′末端错配对PCR的影响：15份Y2扩增阴性标本，用兼并引物作PCR后有7份标本检测阳性，其测序结果见表2，7份标本在引物结合区3′末端均可见碱基突变。4份拉米夫定治疗后复发病人的血清标本用Y2引物扩增结果均为阴性，而用兼并引物扩增4份血清标本有2例发生YMDD变异（为YIDD或YVDD变异）。同时，在每份标本的被检基因片段的上游或下游引物3’末端结合区发生了变异。序列测序结果见表3。
综合结果2和结果3，通过降低退火温度及减少3′末端错配的方法使PCR检测阳性率由81.7%(67/82)增加至92.7%(76/82)，二者比较相差显著（P < 0.05）。
表2 兼并引物扩增产物测序结果
上游引物区 YMDD编码区 下游引物区
野生株 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT CGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本1 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT AGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本4 TTTGTTCAGTGGTTCGTAGGC TATATTGATGAT CGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本6 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT AGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本7 TTTGTTCAGTGGTTCGTAGGC TATATTGATGAT GGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本12 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT GTAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本13 TTGTTCAGTGGTTCGTAGCA TATATGGATGAT CGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
标本14 TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT TGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
注：黑体字下划线为突变碱基位点
表3 兼并引物扩增4例拉米呋丁治疗无效病人血清PCR产物测序结果
上游引物结合区 YMDD编码区 下游引物结合区
病人A TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT TAGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
病人B TTTGTTCAGTGGTTCGTAGGC TATATTGATGAT TCGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
病人C TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATGGATGAT TGTAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
病人D TTGTTCAGTGGTTCGTAGGG TATATTGATAAT TAGAAAACTGCCTGTAAATAGACCG
注：黑体字下划线为突变碱基位点
讨 论
长期以来，人们较多地注意了PCR的假阳性对检测的影响，而对PCR假阴性问题认识不足。有许多因素可能造成假阴性结果，如标本的抽提方法、试剂质量、反应体系、引物选择等等。要成功地得到靶序列的扩增，PCR要求模板、引物、dNTP、DNA聚合酶和缓冲液之间的无数复杂相互作用。尽管套式/半套式PCR能提高微量核酸标本检测阳性率，但标本的核酸抽提得率是保证PCR获得阳性结果的基础，我们以往的试验[2]发现经典的酚—氯仿抽提法的抽提得率较低，而血清直接煮沸法能获得较高的得率。另外碱裂解法[3]及商品化的核酸抽提试剂盒也推荐使用。不同的试验室有不同的试验条件和环境，因此对于每个试验室，任何一项PCR都必须优化，而不能仅仅根据经验或推荐的反应条件进行，PCR条件的优化是提高检测阳性率必不可少的步骤。
引物的选择很关键，通常根据目的基因的保守区域设计引物，以减少因目的基因碱基突变导致的引物错配而出现假阴性结果。由于HBV DNA P基因区是核酸多变区，可能因为目的基因引物结合区的碱基突变，引物与模板碱基发生错配导致PCR假阴性结果，因此有必要设计多对引物并对引物进行选择。引物与模板碱基的错配包括3′末端和内部的错配，任何错配都会影响PCR的效率，并且3′末端的错配比内部的错配对PCR的损害更大[4]。本试验发现15例Y2扩增阴性标本中有9例为模板引物结合区发生突变所致。虽然，有研究者[5-7]认为PCR对3′末端的错配有一定的容许度，特别是通过设计带有3’末端T的引物可以使检测的假阴性降到最小，但要求对整个PCR反应系统作繁琐的优化以顺应错配。我们采用了3′末端碱基游移兼并引物，即在最初设计的引物基础上将引物3′末端碱基减少1～2个碱基，同时应用引物设计软件使突变引物的各项参数尽量与原来保持一致。由于引物参数基本相同，它们可以在同一PCR反应管内扩增相同模板，而几乎不影响扩增效率。本方法不仅提高了检测的阳性率，还简化了操作的繁琐性。另外，研究者们[8-11]还采取了许多策略以顺应错配，如使用至少25个碱基的引物（Tm > 70℃），高的dNTP浓度以及更低的退火温度等。我们也曾重复类似工作，将Y2引物加长至30个碱基，但它失去了引物本身应该具备的参数条件，不能扩增出目的片段。把引物的退火温度下降5℃，虽然在琼脂糖电泳中可以见到阳性条带，但是非特异性扩增片段过多，不能测序。而降低3℃的退火温度，可以使引物结合区内部的错配的影响减少到最小，从而使检测的阳性率增加。
PCR技术的应用极大地提高了检测的灵敏度，但仍受到许多因素的制约，特别对于象HBV DNA P基因区的核酸多变区，应综合采用优化PCR反应条件，选择引物，降低退火温度以及应用3′末端碱基游移兼并引物等方法可提高基因高突变区PCR检测阳性率。
参 考 文 献
1 缪晓辉,孔宪涛,戚中田. 微反应板酶联夹心杂交定量检测乙型肝炎病毒基因组.中华传染病杂志,2000,18:40-42.
2 徐文胜,缪晓辉,潘怡,等. 不同方法抽提血清HBV DNA得率的比较.肝脏,2001,6:218-220.
3 Urdea MS, Running JA, Horn T, et al. A novel method for the rapid detection of specific nucleotide sequence in crude biological samples without blotting or radioactivity: application to the analysis of hepatitis B virus in human serum. Gene, 1987,61:253-264.
4 黄培堂,俞炜源,陈添弥,等译. .PCR技术试验指南.北京:科学出版社,1998.96.
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