【分享】深圳益生堂生物企业有限公司全血基因组提取试剂使用说明
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全血基因组提取过程包括：
1 、裂解红细胞并沉淀白细胞。
2 、裂解白细胞及其细胞核。
3 、盐析沉淀蛋白，分离基因组。
4 、异丙醇沉淀脱盐并浓缩。
5 、70%乙醇清洗，晾干并用TE缓冲液溶解。
本试剂提取的基因组DNA长度大于20kb, 可用于PCR扩增、内切酶消化以及膜杂交等。
一、 试剂盒组成 （本试剂盒提供的试剂组分, 至少可提取20份300ul全血样本的，每种组分均有足够的富余量）
1． 红细胞裂解液：20ml/1瓶。 4. TE 缓冲液（DNA溶解液）：4ml/1瓶。
2． 细胞核裂解液：8ml/1瓶。 5. 操作说明书一份。
3． 蛋白沉淀液： 4ml/1瓶。
二、 本试剂盒未提供，须用户自备的试剂为：异丙醇（国产分析纯），70%乙醇。
三、 全血基因组提取操作程序：
1． 样本要求：用于DNA提取的全血应为抗凝血（EDTA, 肝素或柠檬酸钠抗凝），抗凝血在-20°C存放一个月以内,4°C存放5天以内，均能纯化出高质量的DNA。-80°C条件下，样本至少可存放2年。
2． 全血需求量：本试剂盒可一次提取少至20-300ul, 多至10ml的全血DNA,标准提取量为300ul，预期提取量为：5-15ug。各种容积全血基因组DNA提取所需的溶液组份量见下表：
3． 以300ul或3ml全血为例，将900ul或9ml红细胞裂解液分别加入1.5ml或15ml离心管中。
4． 轻轻弹动或上下颠倒使全血各成分混匀，加入300ul或3ml全血至红细胞裂解液中。上下颠倒5-6次使两者混匀。
5． 室温下待红细胞裂解（新鲜血裂解时间常达10分钟.左右），此间可颠倒2-3次，离心; 陈旧血混匀后可马上离心（对于300ul全血来说13000-16000×g, 离心20秒钟； 对于3ml全血来说2000×g，离心10分钟）。
6． 尽量倾去上清，不要扰动底部沉淀，对于300ul全血来说，保留大约10-20ul残液； 对于3ml全血来说，保留大约50-100ul残液。
（注意：沉淀足量的，含有较少红细胞残留的白细胞是成功的关键，有时离心沉淀液中无明显团块沉淀，只有少量透明絮状沉淀，这可能与白细胞溶解有关，保留透明絮状沉淀，继续进行提取，往往也能提出高质量的DNA）
7．加入核裂解液，对于300ul全血，加300ul裂解液；对于3ml全血，加3ml裂解液。混璇器震荡管底20秒，或用手指弹击管壁，或上下颠倒离心管，促使核裂解，此时，溶液应变得粘稠。如果此时，见到块状不溶物，说明裂解不充分，此时，应在55?C-65?C左右水浴中助溶10-20分钟。（3ml血以上应在55?C-65?C左右水浴中助溶1h或者室温过夜。）
8． 加入裂解液1/3体积的蛋白沉淀液，上下颠倒若干次，充分混匀，可见块状蛋白沉淀开始出现。(注意：白细胞核完全融解，蛋白成分充分沉淀是纯化成功的关键，裂解时有可见团块时，各种处理方法对DNA的损害程度从小到大依次为：55?C-65?C加热，来回倒置，手指轻轻弹动，漩涡震荡，如果加入蛋白沉淀液，离心后，吸出上清前，上清仍较混浊，或因红细胞碎片存在而呈红色，应在上清中再加入适量蛋白沉淀液，混匀后再次离心，室温条件下，上清中的DNA至少可保存18个月)(曾经试过加入蛋白沉淀液仍无法完全沉淀，后用10ul全血+30ul核裂解液，制作成血红蛋白溶液加入其中混匀吸附沉淀，效果较好。)
9． 离心（对于300ul全血，13000-16000×g,离心3分钟；对于3ml全血来说，2000×g, 离心10分钟）。
10 将上清液转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，此时可见透明的絮状物，混匀后离心，同步骤9，倾去上清。
11 离心管中加入与核裂解液等体积的70%的乙醇溶液，来回倒置，清洗管壁，离心同上。
12 移去70%乙醇，倒置离心管于干净的滤纸上，自然干燥10-15分钟，按上表量加入TE缓冲液。
13 快速漩涡震荡1-2秒，使TE缓冲液冲刷到所有沉淀的DNA。
65?C水浴1小时，或4?C过夜使DNA充分溶解（要求不严格的PCR试验可缩短时间或省去该步），轻轻弹动管壁有助于溶解。
1 、裂解红细胞并沉淀白细胞。
2 、裂解白细胞及其细胞核。
3 、盐析沉淀蛋白，分离基因组。
4 、异丙醇沉淀脱盐并浓缩。
5 、70%乙醇清洗，晾干并用TE缓冲液溶解。
本试剂提取的基因组DNA长度大于20kb, 可用于PCR扩增、内切酶消化以及膜杂交等。
一、 试剂盒组成 （本试剂盒提供的试剂组分, 至少可提取20份300ul全血样本的，每种组分均有足够的富余量）
1． 红细胞裂解液：20ml/1瓶。 4. TE 缓冲液（DNA溶解液）：4ml/1瓶。
2． 细胞核裂解液：8ml/1瓶。 5. 操作说明书一份。
3． 蛋白沉淀液： 4ml/1瓶。
二、 本试剂盒未提供，须用户自备的试剂为：异丙醇（国产分析纯），70%乙醇。
三、 全血基因组提取操作程序：
1． 样本要求：用于DNA提取的全血应为抗凝血（EDTA, 肝素或柠檬酸钠抗凝），抗凝血在-20°C存放一个月以内,4°C存放5天以内，均能纯化出高质量的DNA。-80°C条件下，样本至少可存放2年。
2． 全血需求量：本试剂盒可一次提取少至20-300ul, 多至10ml的全血DNA,标准提取量为300ul，预期提取量为：5-15ug。各种容积全血基因组DNA提取所需的溶液组份量见下表：
| <center> <font>全血量</font></center> | <center> <font>红细胞裂解液量</font></center> | <center> <font>细胞核裂解液量</font></center> | <center> <font>蛋白沉淀液量</font></center> | <center> <font>异丙醇量</font></center> | <center> <font>70%乙醇量</font></center> | <center> <font>DNA溶解液量</font></center> |
|
20 ul |
<center> <font>60 ul</font></center> |
200 ul |
66 ul |
266 ul |
266 ul |
10 ul |
| <center> <font>50 ul</font></center> | <center> <font>150ul</font></center> |
200 ul |
66 ul |
266 ul |
266 ul |
<center> <font>25 ul</font></center> |
| <center> <font>100ul</font></center> | <center> <font>300</font></center> | <center> <font>200ul</font></center> |
66 ul |
266 ul |
266 ul |
<center> <font>33 ul</font></center> |
|
300ul |
<center> <font>900ul</font></center> |
300ul |
100ul |
400ul |
400ul |
<center> <font>100ul</font></center> |
|
1ml |
<center> <font>3ml</font></center> | <center> <font>1 ml</font></center> |
333ul |
1.33ml |
1.33ml |
<center> <font>150ul</font></center> |
|
10ml |
<center> <font>30ml</font></center> | <center> <font>10ml</font></center> |
3ml |
13ml |
13ml |
<center> <font>1ml</font></center> |
3． 以300ul或3ml全血为例，将900ul或9ml红细胞裂解液分别加入1.5ml或15ml离心管中。
4． 轻轻弹动或上下颠倒使全血各成分混匀，加入300ul或3ml全血至红细胞裂解液中。上下颠倒5-6次使两者混匀。
5． 室温下待红细胞裂解（新鲜血裂解时间常达10分钟.左右），此间可颠倒2-3次，离心; 陈旧血混匀后可马上离心（对于300ul全血来说13000-16000×g, 离心20秒钟； 对于3ml全血来说2000×g，离心10分钟）。
6． 尽量倾去上清，不要扰动底部沉淀，对于300ul全血来说，保留大约10-20ul残液； 对于3ml全血来说，保留大约50-100ul残液。
（注意：沉淀足量的，含有较少红细胞残留的白细胞是成功的关键，有时离心沉淀液中无明显团块沉淀，只有少量透明絮状沉淀，这可能与白细胞溶解有关，保留透明絮状沉淀，继续进行提取，往往也能提出高质量的DNA）
7．加入核裂解液，对于300ul全血，加300ul裂解液；对于3ml全血，加3ml裂解液。混璇器震荡管底20秒，或用手指弹击管壁，或上下颠倒离心管，促使核裂解，此时，溶液应变得粘稠。如果此时，见到块状不溶物，说明裂解不充分，此时，应在55?C-65?C左右水浴中助溶10-20分钟。（3ml血以上应在55?C-65?C左右水浴中助溶1h或者室温过夜。）
8． 加入裂解液1/3体积的蛋白沉淀液，上下颠倒若干次，充分混匀，可见块状蛋白沉淀开始出现。(注意：白细胞核完全融解，蛋白成分充分沉淀是纯化成功的关键，裂解时有可见团块时，各种处理方法对DNA的损害程度从小到大依次为：55?C-65?C加热，来回倒置，手指轻轻弹动，漩涡震荡，如果加入蛋白沉淀液，离心后，吸出上清前，上清仍较混浊，或因红细胞碎片存在而呈红色，应在上清中再加入适量蛋白沉淀液，混匀后再次离心，室温条件下，上清中的DNA至少可保存18个月)(曾经试过加入蛋白沉淀液仍无法完全沉淀，后用10ul全血+30ul核裂解液，制作成血红蛋白溶液加入其中混匀吸附沉淀，效果较好。)
9． 离心（对于300ul全血，13000-16000×g,离心3分钟；对于3ml全血来说，2000×g, 离心10分钟）。
10 将上清液转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，此时可见透明的絮状物，混匀后离心，同步骤9，倾去上清。
11 离心管中加入与核裂解液等体积的70%的乙醇溶液，来回倒置，清洗管壁，离心同上。
12 移去70%乙醇，倒置离心管于干净的滤纸上，自然干燥10-15分钟，按上表量加入TE缓冲液。
13 快速漩涡震荡1-2秒，使TE缓冲液冲刷到所有沉淀的DNA。
65?C水浴1小时，或4?C过夜使DNA充分溶解（要求不严格的PCR试验可缩短时间或省去该步），轻轻弹动管壁有助于溶解。
