【专题讨论】western blotting 培养细胞的蛋白粗提时，用注射器抽吸和超声波破碎有区别吗
丁香园论坛
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我做了半年western blotting了，p53，p15都能做出来，就是做不出来p21和p27.万般无奈，买了CST的9932#cell cycle sample kit，可还是做不出来。上周给CST发了质量投诉报告，老外处理的很积极，5天之内就给我发来了反馈意见。我的操作基本上是按照CST的说明书进行。只有一点不同，我制备蛋白样品的时候用1毫升注射器在冰浴中反复快速抽吸RIPA-细胞悬液，直到液体清亮为止。我没有按说明书上要求的用超声波来破碎细胞，因为我们实验实验室没有此仪器。交投诉报告的时候，我撒了谎，说用了超声波，可老外通过图片怀疑我没有用超声波，眼睛也够刁的。
我现在想向论坛内的高手们讨教，粗提培养细胞的蛋白时，用注射器抽吸和超声波破碎有区别吗，或者说超声波处理是必要步骤吗。
下面我把我的操做步骤和图片，以及CST的反馈意见贴上来，请高手们指点。我先得声明，我没有任何指责CST的意图，因为他们在五天之内就给出了反馈意见，还是非常积极的，我很佩服。
1.Place the cell culture dish in ice and wash the cells with ice-cold PBS, drain the PBS, then add ice-cold lysis buffer (0.4ml per 5x106 cells/60mm dish). Scrape adherent cells off the dish using a cold plastic cell scraper then gently transfer the cell suspension into a pre-cooled microfuge tube.
2.Sonicate for 15 seconds to shear DNA and reduce sample viscosity. Centrifuge in a microcentrifuge at 4°C for 20 min at 12000 rpm .Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice, aspirate the supernatant and place in a fresh tube kept on ice, and discard the pellet.
就这一步我用了注射器快速反复抽吸，没用超声波。
3.Add 80 µl 5 X loading buffer to 320 µl lysate to prepare the loading sample . Heat a 400 µl sample to 95–100°C for 10 minutes; cool on ice. Microcentrifuge for 5 minutes.
4. Load protein lysate onto SDS-PAGE gel(20 µl per well) ,and load prestained molecular weight markers(SM1811,Fermentas)
5.在15%的SDS-PAGE 胶80伏/30min.+120/90min.垂直电泳，用伯乐的mini3槽
6.转膜，100伏恒压1小时，4度。膜是0.45的PVDF膜，转膜缓冲液配方：：14.4g甘氨酸，3.0.g Tris，甲醇200ml，补足去离子水至1000ml
7.转膜完毕，我把转好的膜按蛋白marker剪切为7块，分别和不同的一抗杂交，之后处理过程都按标准话流程操作，一抗杂交和二抗杂交我都是在四度进行，一抗杂交是过夜，二抗杂交了四个小时。
8为了完全确定抗体有效，我曝光过夜。
这是我的结果
我现在想向论坛内的高手们讨教，粗提培养细胞的蛋白时，用注射器抽吸和超声波破碎有区别吗，或者说超声波处理是必要步骤吗。
下面我把我的操做步骤和图片，以及CST的反馈意见贴上来，请高手们指点。我先得声明，我没有任何指责CST的意图，因为他们在五天之内就给出了反馈意见，还是非常积极的，我很佩服。
1.Place the cell culture dish in ice and wash the cells with ice-cold PBS, drain the PBS, then add ice-cold lysis buffer (0.4ml per 5x106 cells/60mm dish). Scrape adherent cells off the dish using a cold plastic cell scraper then gently transfer the cell suspension into a pre-cooled microfuge tube.
2.Sonicate for 15 seconds to shear DNA and reduce sample viscosity. Centrifuge in a microcentrifuge at 4°C for 20 min at 12000 rpm .Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice, aspirate the supernatant and place in a fresh tube kept on ice, and discard the pellet.
就这一步我用了注射器快速反复抽吸，没用超声波。
3.Add 80 µl 5 X loading buffer to 320 µl lysate to prepare the loading sample . Heat a 400 µl sample to 95–100°C for 10 minutes; cool on ice. Microcentrifuge for 5 minutes.
4. Load protein lysate onto SDS-PAGE gel(20 µl per well) ,and load prestained molecular weight markers(SM1811,Fermentas)
5.在15%的SDS-PAGE 胶80伏/30min.+120/90min.垂直电泳，用伯乐的mini3槽
6.转膜，100伏恒压1小时，4度。膜是0.45的PVDF膜，转膜缓冲液配方：：14.4g甘氨酸，3.0.g Tris，甲醇200ml，补足去离子水至1000ml
7.转膜完毕，我把转好的膜按蛋白marker剪切为7块，分别和不同的一抗杂交，之后处理过程都按标准话流程操作，一抗杂交和二抗杂交我都是在四度进行，一抗杂交是过夜，二抗杂交了四个小时。
8为了完全确定抗体有效，我曝光过夜。
这是我的结果
