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自由基与衰老关系的研究进展
随着老龄人口的比率越来越高,阐明衰老的机制,延缓衰老,提高老年生活质量成为日益迫切的要求。自由基在衰老的发生发展中具有重要作用,是衰老机制的研究热点,许多学者对此进行了系统深入的研究,并取得了阶段性进展,本文就此作一综述。
1 衰 老
1.1衰老的概述:衰老是指生物体发育成熟后,随着年龄的增长,机体在形态、结构、功能方面出现的种种不利变化[1],如皮肤变薄起皱、色素形成、器官老化、智力下降等,衰老是一种正常的生理学过程,是所有生物的共同特征。衰老常伴随进行性病理变化,出现老年性疾病。对衰老现象的理论解释很多,如:自由基学说,基因学说,端粒学说等。其中影响最深的是1956年著名学者Harman提出的自由基学说(Freeradical theory),并得到众多研究[2,3]的支持。自由基学说认为与衰老相关的环境、疾病及自身因素所产生的自由基是衰老的诱因,其化学基础是广泛存在于生物体内的自由基反应。
1.2 衰老的细胞水平改变:衰老细胞出现的特征性变化主要表现在细胞皱缩、数量减少,细胞膜通透性、脆性增加,核膜内折,细胞器数量特别是线粒体数量减少,胞内出现脂褐素等异常物质沉积,最终出现细胞凋亡和细胞坏死。
1.3 衰老的分子水平改变:衰老细胞会出现糖、脂、蛋白质、DNA等细胞成分损伤:细胞内氧化蛋白(羟基化蛋白)增加[4],重要蛋白酶出现氧化、糖基化修饰,活性下降;线粒体DNA和核DNA出现氧化损伤、突变增多、DNA端粒缩短等褪变现象。因此,有人将衰老定义为机体对脂类、蛋白质、DNA不可修复破坏的终生积累。
2 自由基
2.1 自由基的产生:自由基(Free radical)是指能独立存在、含有一个或一个以上未配对电子的分子、原子或离子。主要包括:氧自由基(如羟自由基·OH)、氢自由基(H·)、碳自由基、脂自由基等,其中·OH的化学性质最活泼。人体内自由基的产生有两方面:一是环境中的高温、辐射、光解、化学物质等导致共价键均裂产生的外源性自由基[5]:二是体内各种代谢反应产生的内源性自由基。内源性自由基是人体自由基的主要来源,其产生的主要途径有①经线粒体呼吸链电子泄漏产生线粒体内自由基[6]:线粒体呼吸链是细胞有氧呼吸的重要部位,一般情况下一分子还原氢、两个电子经呼吸链传递给氧生成H20。如果呼吸链还原电位较低的部位出现电子泄漏,就会产生自由基,其常见部位是复合体I中黄素蛋白和复合体Ⅲ的细胞色素b556处;②经微粒体混合功能氧化酶等催化底物羟化产生的线粒体外自由基。此外,机体血红蛋白、肌红蛋白中还可通过非酶促反应产生自由基。
2.2 自由基的高活性与作用:自由基是机体代谢正常的中间产物,低浓度自由基是机体执行正常生理功能所必需。但自由基含有未配对电子,具有高度反应活性,可引发链式自由基反应,过量的自由基会损伤机体。正常情况下机体内存在能清除自由基的酶如超氧化物歧化酶和小分子抗氧化剂(如VitE等)可清除过量的自由基,使自由基的产生和清除处于动态平衡。如果自由基产生过多或清除障碍,这种动态平衡被打破,过量自由基在体内堆积就会引发一系列自由基反应:自由基与多不饱和脂酸(PUFA)、酶、蛋白质发生过氧化反应生成过氧化物。引起脂质、蛋白质分子交联沉积,损伤重要的酶、蛋白质、脂类、DNA,导致膜损伤,重要的酶失
活,DNA突变,从而引起衰老各种现象的发生。
3 自由基与衰老的关系
3.1 自由基与膜损伤:自由基与多不饱和脂酸(PUFA)发生脂质过氧化反应,通过自由基抽提PUFA中的氢,生成脂质过氧化物。这些氧化性产物进一步与其他细胞成分作用,引发链式反应,放大自由基的作用,最终发生PUFA间分子重排、交联。由于PUFA主要存在于细胞膜磷脂中,故脂质过氧化反应主要损伤生物膜,引起膜通透性和硬度增加,细胞内环境稳定性改变。
3.2 自由基与蛋白质损伤:生物体内的自由基与蛋白质发生过氧化反应,能引起蛋白质分子交联。Stadt man ER等[4,7]研究发现衰老细胞内的羰基含量增多,细胞内的氧化蛋白(羟基化蛋白)增加,最终氧化蛋白质积聚、沉积,使重要功能蛋白质如酶失活;此外,脂质过氧化的分解产物醛类(主要是烯醛)也能与蛋白质的氨基(NH2)反应使蛋白质分子交联引起蛋白质积聚。氧化蛋白的增加及其功能改变推进了衰老进程。
3.3 自由基与DNA损伤:核酸含有亲核基团,自由基能与其碱基反应使DNA链聚积。同时脂质过氧化反应的产物烯醛与核酸反应,使DNA链烷化断裂,导致基因序列改变、基因突变,进而引起衰老现象。
3.4 自由基反应的中间产物与衰老:经典的自由基-衰老学说认为自由基直接引发的自由基反应是衰老机制的基础,但近年的研究认为自由基反应产生的中间产物对细胞的损伤在衰老机制中扮演着更重要的角色。因为活泼的自由基是短寿命基团,自由基直接引发的自由基反应不能在细胞内传播,不能损伤远距离的细胞成分,故不能解释自由基引起的持续而广泛的损伤。而自由基反应产生的醛、酮结构中间产物如丙烯醛、4-羟基壬烯醛、丙二醛等羰基化合物,化学性质活泼,可在细胞内广泛扩散,引起细胞成分继发性损伤:①羰-氨反应:醛式产物与蛋白质游离氨基反应,两分子蛋白质通过羰-氨反应交联生成Schiff碱,这种交联可发生在蛋白质内部或分子间,多次交联后形成大分子,使蛋白质变性失活,功能受到影响。不仅是蛋白质,凡是含有游离氨基的化合物如核酸碱基等均可发生羰-氨反应,使DNA烷化、断裂,加速衰老进程。②烯基与巯基化合物反应:巯基化合物能与醛式产物中的烯基反应,形成加成物。机体内含巯基的化合物多为重要功能酶和蛋白质如谷胱甘肽(GSH)等,生成加成物后巯基失活,使蛋白质和酶功能受损。特别是含有两个或多个功能基团的羰基化合物(Dmcarbinyls,DMCS),其反应活性更强,能自发与许多重要生物基团反应,广泛引发生物大分子交联和聚集,加速细胞衰老。这就是目前引起广泛重视的羰基应激衰老理论,该理论认为DMCS的毒害可能是生物衰老的核心过程[8],较自由基自身引发的反应更为重要。
3.5 线粒体DNA(mtDNA)与衰老
3.5.1 自由基与线粒体DNA:线粒体是细胞进行有氧呼吸产生能量的“工厂”。90%的氧在线粒体中进行氧化作用产能,其中2%生成副产品HO2和多种类型的自由基,统称为活性氧(ROS)。因此线粒体是自由基浓度最高的细胞器,最易受自由基伤害。mtDNA是双链环状DNA,裸露于基质中,缺乏组蛋白和其他结合蛋白的保护;而催化mtDNA复制的DNA聚合酶r不具有校读功能,mtDNA复制错误频率高,同时缺乏有效的修复酶,故mtDNA突变后修复能力差。mtDNA位置接近线粒体内膜呼吸链并直接暴露于氧化磷酸化过程产生的高浓度自由基中,极易受自由基攻击而发生突变,其突变率是核DNA的10倍—20倍。
3.5.2 mtDNA的损伤与衰老:ROS对线粒体DNA的损伤和衰老的关系是目前研究较多的领域[9]。mtDNA主要编码呼吸链中的13种酶,其突变将导致这些功能酶不能表达使呼吸链功能受损,造成能量亏耗,而能量亏耗的累积,反过来又会进一步引起自由基的堆积,如此反复循环。mtDNA的损伤累积随增龄而增多,导致能量转换酶系统功能异常,增加线粒体内的氧化应激水平引起衰老的出现。自由基损伤mtD-NA机制主要通过氧化作用[9],mtDNA氧化损伤可以是碱基片段丢失、碱基修饰及插入突变等,其中以片段缺失较为多见。Fusako Maehira等[10]在实验中发现鼠脑、肝、肺细胞中
8—羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)的含量随着增龄而增多。自由基能使mtDNA上脱氧鸟苷(dG)羟基化形成8-OH-dG,使碱基不能正常配对,从而导致DNA双链解离形成大片段的单链DNA,发生缺失。衰老个体细胞中mtDNA缺失表现明显,并随着年龄的增加而增加,许多研究认为mtDNA缺失与衰老及伴随的老年衰退性疾病有密切关系[9。11],自由基引起的mtDNA损伤是引起衰老的关键因素。
3.6 自由基引发细胞凋亡在衰老中的作用
3.7 3.6.1 细胞凋亡:细胞凋亡是指机体自己启动由细胞本身主动调控的具有一定程序的死亡,故又称编程性细胞死亡。细胞凋亡的特征表现为细胞收缩,核固缩,胞膜形成泡状突起与胞体分离形成凋亡小体。随后凋亡小体被邻近细胞吞噬或凋亡小体自行降解。细胞凋亡时细胞膜、线粒体、溶酶体等结构保留。细胞凋亡参与机体许多重要的生理病理过程。
3.6.2 自由基、细胞凋亡与衰老的关系:自由基在细胞凋亡中起重要作用,主要依据有:许多化学物质如砷剂诱导细胞凋亡通过提高细胞中ROS的含量实现[2];肿瘤坏死因子(TNF)能诱导ROS的产生引发细胞凋亡,如加人ROS会加速细胞凋亡,而超氧化物歧化酶(SOD)和抗氧化剂可阻止细胞凋亡的发生。目前认为自由基引起细胞凋亡的机制是ROS使线粒体内膜的渗透性转换孔道PTP(permeability transition-pore)[13]激活开放,引起线粒体内膜跨膜电位△ψm下降,胞液中H2O和小分子物质进入基质中使线粒体内膜嵴拉直、外膜破裂,线粒体中的细胞色素氧化酶C(cytc)等物质释出。细胞色素氧化酶C可活化胞液中的caspase蛋白酶家族14。
细胞色素氧化酶C首先激活caspase—9,通过caspase—9进一步激活caspase—3,形成级联反应,caspase—3作为细胞凋亡的中心执行者,可水解多种底物蛋白引起细胞凋亡的发生;bc1-2家族也是研究较多的凋亡相关因子,bc1-2家族中有抗凋亡因子如bcl-2、bc1-XLX和促凋亡因子Bax、bad等15。bcl-2有抑制细胞凋亡的作用,主要通过调节细胞内ROS对细胞凋亡进行调控,而bcl-2过表达可使细胞色素氧化酶C释放引起细胞凋亡;另外有研究表明ROS对DNA的损伤可使凋亡相关基因P53表达增加引起细胞凋亡[16]。值得一提的是NO在细胞凋亡的作用,NO本身就是一种自由基,而且还可通过硝基化反应生成其他自由基,NO能通过多种机制诱导凋亡[17]。以上证据表明自由基参与了细胞凋亡过程。细胞凋亡与衰老的直接关系虽还未完全弄清,但目前认为:细胞凋亡通过破坏机体重要细胞,特别是非再生性细胞(如神经元),使其数量减少,造成机体重要器官的功能障碍,在衰老过程中起重要作用,特别是与衰老伴随的进行性病理过程密切相关。
4 结 语
自由基和衰老的关系密切,自由基自身引发的自由基反应及产生的中间产物羰基化合物可能诱导了衰老发生,mtD-NA的损伤推进了衰老进程。随着自由基、细胞凋亡与衰老三者X间相互关系的深入研究,将为衰老机制的阐明开辟另一途径。
随着老龄人口的比率越来越高,阐明衰老的机制,延缓衰老,提高老年生活质量成为日益迫切的要求。自由基在衰老的发生发展中具有重要作用,是衰老机制的研究热点,许多学者对此进行了系统深入的研究,并取得了阶段性进展,本文就此作一综述。
1 衰 老
1.1衰老的概述:衰老是指生物体发育成熟后,随着年龄的增长,机体在形态、结构、功能方面出现的种种不利变化[1],如皮肤变薄起皱、色素形成、器官老化、智力下降等,衰老是一种正常的生理学过程,是所有生物的共同特征。衰老常伴随进行性病理变化,出现老年性疾病。对衰老现象的理论解释很多,如:自由基学说,基因学说,端粒学说等。其中影响最深的是1956年著名学者Harman提出的自由基学说(Freeradical theory),并得到众多研究[2,3]的支持。自由基学说认为与衰老相关的环境、疾病及自身因素所产生的自由基是衰老的诱因,其化学基础是广泛存在于生物体内的自由基反应。
1.2 衰老的细胞水平改变:衰老细胞出现的特征性变化主要表现在细胞皱缩、数量减少,细胞膜通透性、脆性增加,核膜内折,细胞器数量特别是线粒体数量减少,胞内出现脂褐素等异常物质沉积,最终出现细胞凋亡和细胞坏死。
1.3 衰老的分子水平改变:衰老细胞会出现糖、脂、蛋白质、DNA等细胞成分损伤:细胞内氧化蛋白(羟基化蛋白)增加[4],重要蛋白酶出现氧化、糖基化修饰,活性下降;线粒体DNA和核DNA出现氧化损伤、突变增多、DNA端粒缩短等褪变现象。因此,有人将衰老定义为机体对脂类、蛋白质、DNA不可修复破坏的终生积累。
2 自由基
2.1 自由基的产生:自由基(Free radical)是指能独立存在、含有一个或一个以上未配对电子的分子、原子或离子。主要包括:氧自由基(如羟自由基·OH)、氢自由基(H·)、碳自由基、脂自由基等,其中·OH的化学性质最活泼。人体内自由基的产生有两方面:一是环境中的高温、辐射、光解、化学物质等导致共价键均裂产生的外源性自由基[5]:二是体内各种代谢反应产生的内源性自由基。内源性自由基是人体自由基的主要来源,其产生的主要途径有①经线粒体呼吸链电子泄漏产生线粒体内自由基[6]:线粒体呼吸链是细胞有氧呼吸的重要部位,一般情况下一分子还原氢、两个电子经呼吸链传递给氧生成H20。如果呼吸链还原电位较低的部位出现电子泄漏,就会产生自由基,其常见部位是复合体I中黄素蛋白和复合体Ⅲ的细胞色素b556处;②经微粒体混合功能氧化酶等催化底物羟化产生的线粒体外自由基。此外,机体血红蛋白、肌红蛋白中还可通过非酶促反应产生自由基。
2.2 自由基的高活性与作用:自由基是机体代谢正常的中间产物,低浓度自由基是机体执行正常生理功能所必需。但自由基含有未配对电子,具有高度反应活性,可引发链式自由基反应,过量的自由基会损伤机体。正常情况下机体内存在能清除自由基的酶如超氧化物歧化酶和小分子抗氧化剂(如VitE等)可清除过量的自由基,使自由基的产生和清除处于动态平衡。如果自由基产生过多或清除障碍,这种动态平衡被打破,过量自由基在体内堆积就会引发一系列自由基反应:自由基与多不饱和脂酸(PUFA)、酶、蛋白质发生过氧化反应生成过氧化物。引起脂质、蛋白质分子交联沉积,损伤重要的酶、蛋白质、脂类、DNA,导致膜损伤,重要的酶失
活,DNA突变,从而引起衰老各种现象的发生。
3 自由基与衰老的关系
3.1 自由基与膜损伤:自由基与多不饱和脂酸(PUFA)发生脂质过氧化反应,通过自由基抽提PUFA中的氢,生成脂质过氧化物。这些氧化性产物进一步与其他细胞成分作用,引发链式反应,放大自由基的作用,最终发生PUFA间分子重排、交联。由于PUFA主要存在于细胞膜磷脂中,故脂质过氧化反应主要损伤生物膜,引起膜通透性和硬度增加,细胞内环境稳定性改变。
3.2 自由基与蛋白质损伤:生物体内的自由基与蛋白质发生过氧化反应,能引起蛋白质分子交联。Stadt man ER等[4,7]研究发现衰老细胞内的羰基含量增多,细胞内的氧化蛋白(羟基化蛋白)增加,最终氧化蛋白质积聚、沉积,使重要功能蛋白质如酶失活;此外,脂质过氧化的分解产物醛类(主要是烯醛)也能与蛋白质的氨基(NH2)反应使蛋白质分子交联引起蛋白质积聚。氧化蛋白的增加及其功能改变推进了衰老进程。
3.3 自由基与DNA损伤:核酸含有亲核基团,自由基能与其碱基反应使DNA链聚积。同时脂质过氧化反应的产物烯醛与核酸反应,使DNA链烷化断裂,导致基因序列改变、基因突变,进而引起衰老现象。
3.4 自由基反应的中间产物与衰老:经典的自由基-衰老学说认为自由基直接引发的自由基反应是衰老机制的基础,但近年的研究认为自由基反应产生的中间产物对细胞的损伤在衰老机制中扮演着更重要的角色。因为活泼的自由基是短寿命基团,自由基直接引发的自由基反应不能在细胞内传播,不能损伤远距离的细胞成分,故不能解释自由基引起的持续而广泛的损伤。而自由基反应产生的醛、酮结构中间产物如丙烯醛、4-羟基壬烯醛、丙二醛等羰基化合物,化学性质活泼,可在细胞内广泛扩散,引起细胞成分继发性损伤:①羰-氨反应:醛式产物与蛋白质游离氨基反应,两分子蛋白质通过羰-氨反应交联生成Schiff碱,这种交联可发生在蛋白质内部或分子间,多次交联后形成大分子,使蛋白质变性失活,功能受到影响。不仅是蛋白质,凡是含有游离氨基的化合物如核酸碱基等均可发生羰-氨反应,使DNA烷化、断裂,加速衰老进程。②烯基与巯基化合物反应:巯基化合物能与醛式产物中的烯基反应,形成加成物。机体内含巯基的化合物多为重要功能酶和蛋白质如谷胱甘肽(GSH)等,生成加成物后巯基失活,使蛋白质和酶功能受损。特别是含有两个或多个功能基团的羰基化合物(Dmcarbinyls,DMCS),其反应活性更强,能自发与许多重要生物基团反应,广泛引发生物大分子交联和聚集,加速细胞衰老。这就是目前引起广泛重视的羰基应激衰老理论,该理论认为DMCS的毒害可能是生物衰老的核心过程[8],较自由基自身引发的反应更为重要。
3.5 线粒体DNA(mtDNA)与衰老
3.5.1 自由基与线粒体DNA:线粒体是细胞进行有氧呼吸产生能量的“工厂”。90%的氧在线粒体中进行氧化作用产能,其中2%生成副产品HO2和多种类型的自由基,统称为活性氧(ROS)。因此线粒体是自由基浓度最高的细胞器,最易受自由基伤害。mtDNA是双链环状DNA,裸露于基质中,缺乏组蛋白和其他结合蛋白的保护;而催化mtDNA复制的DNA聚合酶r不具有校读功能,mtDNA复制错误频率高,同时缺乏有效的修复酶,故mtDNA突变后修复能力差。mtDNA位置接近线粒体内膜呼吸链并直接暴露于氧化磷酸化过程产生的高浓度自由基中,极易受自由基攻击而发生突变,其突变率是核DNA的10倍—20倍。
3.5.2 mtDNA的损伤与衰老:ROS对线粒体DNA的损伤和衰老的关系是目前研究较多的领域[9]。mtDNA主要编码呼吸链中的13种酶,其突变将导致这些功能酶不能表达使呼吸链功能受损,造成能量亏耗,而能量亏耗的累积,反过来又会进一步引起自由基的堆积,如此反复循环。mtDNA的损伤累积随增龄而增多,导致能量转换酶系统功能异常,增加线粒体内的氧化应激水平引起衰老的出现。自由基损伤mtD-NA机制主要通过氧化作用[9],mtDNA氧化损伤可以是碱基片段丢失、碱基修饰及插入突变等,其中以片段缺失较为多见。Fusako Maehira等[10]在实验中发现鼠脑、肝、肺细胞中
8—羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)的含量随着增龄而增多。自由基能使mtDNA上脱氧鸟苷(dG)羟基化形成8-OH-dG,使碱基不能正常配对,从而导致DNA双链解离形成大片段的单链DNA,发生缺失。衰老个体细胞中mtDNA缺失表现明显,并随着年龄的增加而增加,许多研究认为mtDNA缺失与衰老及伴随的老年衰退性疾病有密切关系[9。11],自由基引起的mtDNA损伤是引起衰老的关键因素。
3.6 自由基引发细胞凋亡在衰老中的作用
3.7 3.6.1 细胞凋亡:细胞凋亡是指机体自己启动由细胞本身主动调控的具有一定程序的死亡,故又称编程性细胞死亡。细胞凋亡的特征表现为细胞收缩,核固缩,胞膜形成泡状突起与胞体分离形成凋亡小体。随后凋亡小体被邻近细胞吞噬或凋亡小体自行降解。细胞凋亡时细胞膜、线粒体、溶酶体等结构保留。细胞凋亡参与机体许多重要的生理病理过程。
3.6.2 自由基、细胞凋亡与衰老的关系:自由基在细胞凋亡中起重要作用,主要依据有:许多化学物质如砷剂诱导细胞凋亡通过提高细胞中ROS的含量实现[2];肿瘤坏死因子(TNF)能诱导ROS的产生引发细胞凋亡,如加人ROS会加速细胞凋亡,而超氧化物歧化酶(SOD)和抗氧化剂可阻止细胞凋亡的发生。目前认为自由基引起细胞凋亡的机制是ROS使线粒体内膜的渗透性转换孔道PTP(permeability transition-pore)[13]激活开放,引起线粒体内膜跨膜电位△ψm下降,胞液中H2O和小分子物质进入基质中使线粒体内膜嵴拉直、外膜破裂,线粒体中的细胞色素氧化酶C(cytc)等物质释出。细胞色素氧化酶C可活化胞液中的caspase蛋白酶家族14。
细胞色素氧化酶C首先激活caspase—9,通过caspase—9进一步激活caspase—3,形成级联反应,caspase—3作为细胞凋亡的中心执行者,可水解多种底物蛋白引起细胞凋亡的发生;bc1-2家族也是研究较多的凋亡相关因子,bc1-2家族中有抗凋亡因子如bcl-2、bc1-XLX和促凋亡因子Bax、bad等15。bcl-2有抑制细胞凋亡的作用,主要通过调节细胞内ROS对细胞凋亡进行调控,而bcl-2过表达可使细胞色素氧化酶C释放引起细胞凋亡;另外有研究表明ROS对DNA的损伤可使凋亡相关基因P53表达增加引起细胞凋亡[16]。值得一提的是NO在细胞凋亡的作用,NO本身就是一种自由基,而且还可通过硝基化反应生成其他自由基,NO能通过多种机制诱导凋亡[17]。以上证据表明自由基参与了细胞凋亡过程。细胞凋亡与衰老的直接关系虽还未完全弄清,但目前认为:细胞凋亡通过破坏机体重要细胞,特别是非再生性细胞(如神经元),使其数量减少,造成机体重要器官的功能障碍,在衰老过程中起重要作用,特别是与衰老伴随的进行性病理过程密切相关。
4 结 语
自由基和衰老的关系密切,自由基自身引发的自由基反应及产生的中间产物羰基化合物可能诱导了衰老发生,mtD-NA的损伤推进了衰老进程。随着自由基、细胞凋亡与衰老三者X间相互关系的深入研究,将为衰老机制的阐明开辟另一途径。
