简介
了解羟胺氧化法测定氧自由基的原理和方法。
原理
氧自由基产生速率的测定的原理是利用羟胺氧化的方法可以检测生物系统中 O2-含量，0/与羟胺反应生成 NO； ,N（）r 在对氨基苯磺酸和 W 恭胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，染料在 530 nm 有显 著吸收，根据吸光度值可以计算出样品中的 0/含量。根据测得的吸光度值，查 NO；标准 曲线，将吸光度值换算成 ［NO；］, 然后依照羟胺与 0；・的反应式（如下），从 ［NOF］ 对 ［0；・］ 进行化学计量，得到 ［O；・］o 根据记录样品与羟胺反应的时间和样品的鲜重，可求得 O；・产 生速率 Cptmol •（min • mgFW）。
NH.OH + 2O；- +undefined— NO7+H2O2 + H2O
材料与仪器
材料：分别取幼嫩和衰老的植物叶片或其他受逆境胁迫的植物组织。
器材: 研钵，天平，恒温水浴锅，刻度试管，容量瓶，量筒，离心机, 分光光度计。
试剂：
①系列浓度的 NaNO2
②17 mmol・L -1对氨基苯磺酸（2.944 g ・L-1, 以冰醋酸：水=3 ： 1 配制）
③7 mmol・L-1 α-恭胺（1. 0 g・ L-1 , 以冰醋酸：水=3 ： 1 配制）
④50 mmol - L-1 磷酸缓冲液
⑤1 mmol ・ L-1盐酸羟胺（70 mg ・ L-1）
步骤
氧自由基产生速率的测定的基本过程可分为如下几步：
1. 亚硝酸根标准曲线的制作：用 100 Mmol - L_1 NaNO2（7 mg - ）母液配制 0、5、10、 15.20.25 和 30 」nol・L_1 NaNO2 各 2 mL, 分别加入 2 mL 对氨基苯磺酸和 2 mL 蔡胺， 于 25 °C 中保温 20 min, 然后测定 OD 彻，以「NO—和测得的波长 530 nm 的吸光度值作图，制 得亚硝酸根标准曲线。
2. 植物提取液的制备：取上述植物组织 2 g, 加 50 mmol - L 1 磷酸缓冲液（pH 7.8）2 mL, 充分研磨，10 000 r - mirT」离心 20 min,±清液定容至 3 mL. 此液即为 O；・产生待 测液。
3.。/产生速率的测定：0.5 mL 样品提取液中加入 0. 5 mL 50 mmol・L'1 磷酸缓冲液（pH 7.8）和 1. 5 mL 1 mmol - 17 1 盐酸羟胺，摇匀，于 25°C 中保温 1 h, 然后再加入 2 mL 17 mmol - L"对氨基苯磺酸（以冰醋酸：水=3 ： 1 配制） 和 2 mL 7 mmol - L 1 a-紊胺（以冰 醋酸：水=3 ： 1 配制），混合，于 25°C 中保温 20 min, 取出以分光光度计测定波长 530 nm 的 吸光度值。
4. 结果计算：根据实验原理中的反应式计算出不同处理的植物组织中 () 广产生速率，即
宀,…, ln cXV.XN
O2-产生速率项 mol ・(min - gFW) ']= 2X 嵐 7 -
式中：c 一标准曲线上查得的样品中 NO? 浓度平 mol・L)；
N 一样品提取液稀释倍数. 即 4；
峪一样品提取液总体积丄，即 3X10—3 L.
2—0/的物质的量是 NO；的 2 倍；
W 植物组织鲜重，g；
T -反应时间，即 60 min。
注意事项
如果样品中含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品与羟胺温浴后，加入等体积的乙醒萃 取叶绿素，然后再加入对氨基苯磺酸和 a-蔡胺作 NO2 的显色反应。
来源：丁香实验
