【资源】Rac1 Activation Assay
丁香园论坛
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因为自己实验后期需要使用这方面的技术,所以最近在查阅这方面的资料,想拿出来和大家一起分享.后期会把更详细的东西贴出来.英文水平一般,所以翻译的有点差,请海涵.
Rac1 Activation Assay Kit被设计来鉴定贴壁细胞或非贴壁细胞的细胞裂解液中Rac活性数量(i.e. Rac-GTP, rather than the inactive Rac-GDP). 使用的glutathione (GST) pull-down方法，采用GST-agarose beads与有的包含74-89 个氨基酸的N末端调节区的部分p21-activated kinase (PAK-1)相结合。PAK-1的这个区域,被认为是p21偶联区域即P21binding domain (PBD),特异性的与活性形式的Rac1相作用,最终提供了一个优秀的工具以分离细胞样本中的活性Rac1.
细胞被镁盐缓冲溶液（ magnesium lysis buffer)所裂解; 接着裂解液需要采用GST-agarose beads (not provided)进行预清除.在这一步，少量的细胞裂解液能够储存起来以检测蛋白的数量;阳性和阴性对照也需要使用在试剂盒中GTP和 GTP-gamma-S reagents进行准备.然后将PAK-1 PBD beads加入到细胞裂解液中(10 ul of beads for every 500 ul of cell lysate).接着孵育以保证Rac1-GTP的结合，使用buffer 清洗the beads以去除细胞碎片和没有结合的Rac1。 最后，加入 laemmli buffer (not provided)到 beads，将泥浆使用anti-Rac1 antibody 进行Western blot.
有人使用这个试剂盒对贴壁细胞（人动脉内皮细胞，鼠动脉平滑肌细胞）、非贴壁细胞（鼠的淋巴细胞）、以及整个组织样本（猪的心）. 试剂盒对贴壁细胞和非贴壁细胞的说明非常清楚，但是对在组织中的使用却并不明确.
下面是在一篇文章中的实际应用
Pull-Down Assay for GTP-Rac1
HCE cells 在铺设了fibronectin和加或不加BSA 的100-mm dishes培养45分钟，在 0.5 mL of a solution中裂解，其中包括50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10% glycerol甘油, 1% NP-40, 1 mM NaF, 1 mM EGTA, and 1% protease inhibitor蛋白酶抑制物 cocktail. 裂解液在 15,000g 下离心15 minutes, 上清在 (200μg of protein) 4°C 孵育2 hours ，通常来说伴随着20μg of glutathione S-transferase (GST)或者是 GST fusion protein包含了Cdc42/Rac binding domain (CRIB) of PAK1 immobilized on glutathione–Sepharose 4B beads. The beads 用 lysis buffer清洗三次, bound GTP-Rac1 采用Rac1抗体进行免疫印渍分析
就我目前的了解来说,Rac和Cdc42都是可以采取这样的方式来检测其活性的.
Rac1 Activation Assay Kit被设计来鉴定贴壁细胞或非贴壁细胞的细胞裂解液中Rac活性数量(i.e. Rac-GTP, rather than the inactive Rac-GDP). 使用的glutathione (GST) pull-down方法，采用GST-agarose beads与有的包含74-89 个氨基酸的N末端调节区的部分p21-activated kinase (PAK-1)相结合。PAK-1的这个区域,被认为是p21偶联区域即P21binding domain (PBD),特异性的与活性形式的Rac1相作用,最终提供了一个优秀的工具以分离细胞样本中的活性Rac1.
细胞被镁盐缓冲溶液（ magnesium lysis buffer)所裂解; 接着裂解液需要采用GST-agarose beads (not provided)进行预清除.在这一步，少量的细胞裂解液能够储存起来以检测蛋白的数量;阳性和阴性对照也需要使用在试剂盒中GTP和 GTP-gamma-S reagents进行准备.然后将PAK-1 PBD beads加入到细胞裂解液中(10 ul of beads for every 500 ul of cell lysate).接着孵育以保证Rac1-GTP的结合，使用buffer 清洗the beads以去除细胞碎片和没有结合的Rac1。 最后，加入 laemmli buffer (not provided)到 beads，将泥浆使用anti-Rac1 antibody 进行Western blot.
有人使用这个试剂盒对贴壁细胞（人动脉内皮细胞，鼠动脉平滑肌细胞）、非贴壁细胞（鼠的淋巴细胞）、以及整个组织样本（猪的心）. 试剂盒对贴壁细胞和非贴壁细胞的说明非常清楚，但是对在组织中的使用却并不明确.
下面是在一篇文章中的实际应用
Pull-Down Assay for GTP-Rac1
HCE cells 在铺设了fibronectin和加或不加BSA 的100-mm dishes培养45分钟，在 0.5 mL of a solution中裂解，其中包括50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10% glycerol甘油, 1% NP-40, 1 mM NaF, 1 mM EGTA, and 1% protease inhibitor蛋白酶抑制物 cocktail. 裂解液在 15,000g 下离心15 minutes, 上清在 (200μg of protein) 4°C 孵育2 hours ，通常来说伴随着20μg of glutathione S-transferase (GST)或者是 GST fusion protein包含了Cdc42/Rac binding domain (CRIB) of PAK1 immobilized on glutathione–Sepharose 4B beads. The beads 用 lysis buffer清洗三次, bound GTP-Rac1 采用Rac1抗体进行免疫印渍分析
就我目前的了解来说,Rac和Cdc42都是可以采取这样的方式来检测其活性的.
