【原创】Protein A Sepharose 之进化篇。。。
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[img][/img]Protein A 柱之进化
Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质,能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合。因而,将Protein A 与琼脂糖凝胶以一定的方式结合,可制备用于抗体纯化的亲和填料。
早期的Protein A柱结合的都是天然Protein A。天然Protein A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成,分子量约42KD,结构如图1所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强,可以吸附大量的lgG。但同时,天然Protein A的其他非结合域会和非目标蛋白结合,这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够,会影响到后续的试验。
为了解决这些问题,科学家们运用基因工程技术,克隆出Protein A的基因,并对其进行改造,除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组Protein A的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中,的确是提高了产物的纯度。目前,市场上绝大部分重组Protein A柱都是这种产品。但是,纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液,如果洗脱效果不是很理想,还要降低pH,采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见,此法洗脱条件比较剧烈,最后收集的蛋白质很有可能变性,或者是复性困难。
这种洗脱条件剧烈的Protein A 柱结合的重组蛋白质A一般具有5个串联结构域:E、D、A、B、C。这种重组蛋白A虽然除去了不重要的非结合域,仅由5个结构域组成,每个域均可以和IgG的Fc段结合,但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一,而且经常需要较低的pH值。如果减少串联结构域的个数,并且采取同型结构域串联,就可以避免不同结构域与抗体Fc 段亲和性的差异,洗脱条件会温和而均一。为此,我们可以做一个试验,比较一下这两种蛋白质A柱纯化的结果。
待纯化样品:人血清
实验材料:
GE公司的rProtein A Sepharose FF(E、D、A、B、C结构域串联)
Putus公司的rProtein A Sepharose FF(3个B结构域串联)
实验方法:
分别按照每个公司的说明书来操作,洗脱条件分别为pH值3.0和4.5, SDS-PAGE检测结果如下:。
Lane 1 Marker
[img][/img]Protein A 柱之进化
Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质,能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合。因而,将Protein A 与琼脂糖凝胶以一定的方式结合,可制备用于抗体纯化的亲和填料。
早期的Protein A柱结合的都是天然Protein A。天然Protein A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成,分子量约42KD,结构如图1所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强,可以吸附大量的lgG。但同时,天然Protein A的其他非结合域会和非目标蛋白结合,这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够,会影响到后续的试验。
为了解决这些问题,科学家们运用基因工程技术,克隆出Protein A的基因,并对其进行改造,除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组Protein A的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中,的确是提高了产物的纯度。目前,市场上绝大部分重组Protein A柱都是这种产品。但是,纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液,如果洗脱效果不是很理想,还要降低pH,采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见,此法洗脱条件比较剧烈,最后收集的蛋白质很有可能变性,或者是复性困难。
这种洗脱条件剧烈的Protein A 柱结合的重组蛋白质A一般具有5个串联结构域:E、D、A、B、C。这种重组蛋白A虽然除去了不重要的非结合域,仅由5个结构域组成,每个域均可以和IgG的Fc段结合,但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一,而且经常需要较低的pH值。如果减少串联结构域的个数,并且采取同型结构域串联,就可以避免不同结构域与抗体Fc 段亲和性的差异,洗脱条件会温和而均一。为此,我们可以做一个试验,比较一下这两种蛋白质A柱纯化的结果。
待纯化样品:人血清
实验材料:
GE公司的rProtein A Sepharose FF(E、D、A、B、C结构域串联)
Putus公司的rProtein A Sepharose FF(3个B结构域串联)
实验方法:
分别按照每个公司的说明书来操作,洗脱条件分别为pH值3.0和4.5, SDS-PAGE检测结果如下:。
Lane 1 Marker
[img][/img]
SDS-PAGE Result of Human Serum Purification
上图从左边起,1、2、3号孔点的是经过Putus填料洗脱后稀释不同浓度抗体,4、5、6号孔点的是经过GE填料洗脱后稀释不同浓度抗体。7号孔点的是上柱后穿流人血清。8号孔点的是上柱前人血清。9号孔点的是Marker。
从图中,我们可以看出,与GE公司rProtein A Sepharose FF填料从人血清纯化抗体纯度比较,Putus填料纯化的抗体纯度更高。更重要的是,后者的洗脱条件仅为4.5,高于前者的洗脱条件3.4。使用具备较少B结构域的Protein A柱能获得高纯度的IgG,并且洗脱条件温和,对蛋白质的损伤小。
![](http://img.dxycdn.com/upload/2009/08/12/70991059.jpg)
Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质,能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合。因而,将Protein A 与琼脂糖凝胶以一定的方式结合,可制备用于抗体纯化的亲和填料。
早期的Protein A柱结合的都是天然Protein A。天然Protein A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成,分子量约42KD,结构如图1所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强,可以吸附大量的lgG。但同时,天然Protein A的其他非结合域会和非目标蛋白结合,这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够,会影响到后续的试验。
为了解决这些问题,科学家们运用基因工程技术,克隆出Protein A的基因,并对其进行改造,除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组Protein A的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中,的确是提高了产物的纯度。目前,市场上绝大部分重组Protein A柱都是这种产品。但是,纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液,如果洗脱效果不是很理想,还要降低pH,采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见,此法洗脱条件比较剧烈,最后收集的蛋白质很有可能变性,或者是复性困难。
这种洗脱条件剧烈的Protein A 柱结合的重组蛋白质A一般具有5个串联结构域:E、D、A、B、C。这种重组蛋白A虽然除去了不重要的非结合域,仅由5个结构域组成,每个域均可以和IgG的Fc段结合,但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一,而且经常需要较低的pH值。如果减少串联结构域的个数,并且采取同型结构域串联,就可以避免不同结构域与抗体Fc 段亲和性的差异,洗脱条件会温和而均一。为此,我们可以做一个试验,比较一下这两种蛋白质A柱纯化的结果。
待纯化样品:人血清
实验材料:
GE公司的rProtein A Sepharose FF(E、D、A、B、C结构域串联)
Putus公司的rProtein A Sepharose FF(3个B结构域串联)
实验方法:
分别按照每个公司的说明书来操作,洗脱条件分别为pH值3.0和4.5, SDS-PAGE检测结果如下:。
Lane 1 Marker
[img][/img]Protein A 柱之进化
Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质,能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合。因而,将Protein A 与琼脂糖凝胶以一定的方式结合,可制备用于抗体纯化的亲和填料。
早期的Protein A柱结合的都是天然Protein A。天然Protein A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成,分子量约42KD,结构如图1所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强,可以吸附大量的lgG。但同时,天然Protein A的其他非结合域会和非目标蛋白结合,这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够,会影响到后续的试验。
为了解决这些问题,科学家们运用基因工程技术,克隆出Protein A的基因,并对其进行改造,除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组Protein A的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中,的确是提高了产物的纯度。目前,市场上绝大部分重组Protein A柱都是这种产品。但是,纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液,如果洗脱效果不是很理想,还要降低pH,采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见,此法洗脱条件比较剧烈,最后收集的蛋白质很有可能变性,或者是复性困难。
这种洗脱条件剧烈的Protein A 柱结合的重组蛋白质A一般具有5个串联结构域:E、D、A、B、C。这种重组蛋白A虽然除去了不重要的非结合域,仅由5个结构域组成,每个域均可以和IgG的Fc段结合,但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一,而且经常需要较低的pH值。如果减少串联结构域的个数,并且采取同型结构域串联,就可以避免不同结构域与抗体Fc 段亲和性的差异,洗脱条件会温和而均一。为此,我们可以做一个试验,比较一下这两种蛋白质A柱纯化的结果。
待纯化样品:人血清
实验材料:
GE公司的rProtein A Sepharose FF(E、D、A、B、C结构域串联)
Putus公司的rProtein A Sepharose FF(3个B结构域串联)
实验方法:
分别按照每个公司的说明书来操作,洗脱条件分别为pH值3.0和4.5, SDS-PAGE检测结果如下:。
Lane 1 Marker
[img][/img]
SDS-PAGE Result of Human Serum Purification
上图从左边起,1、2、3号孔点的是经过Putus填料洗脱后稀释不同浓度抗体,4、5、6号孔点的是经过GE填料洗脱后稀释不同浓度抗体。7号孔点的是上柱后穿流人血清。8号孔点的是上柱前人血清。9号孔点的是Marker。
从图中,我们可以看出,与GE公司rProtein A Sepharose FF填料从人血清纯化抗体纯度比较,Putus填料纯化的抗体纯度更高。更重要的是,后者的洗脱条件仅为4.5,高于前者的洗脱条件3.4。使用具备较少B结构域的Protein A柱能获得高纯度的IgG,并且洗脱条件温和,对蛋白质的损伤小。
![](http://img.dxycdn.com/upload/2009/08/12/70991059.jpg)