【原创】Protein A Sepharose 之进化篇。。。

[img][/img]Protein A 柱之进化

Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。因而，将Protein A 与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可制备用于抗体纯化的亲和填料。

早期的Protein A柱结合的都是天然Protein A。天然Protein A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成，分子量约42KD，结构如图1所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量的lgG。但同时，天然Protein A的其他非结合域会和非目标蛋白结合，这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够，会影响到后续的试验。

为了解决这些问题，科学家们运用基因工程技术，克隆出Protein A的基因，并对其进行改造，除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组Protein A的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中，的确是提高了产物的纯度。目前，市场上绝大部分重组Protein A柱都是这种产品。但是，纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液，如果洗脱效果不是很理想，还要降低pH，采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见，此法洗脱条件比较剧烈，最后收集的蛋白质很有可能变性，或者是复性困难。

这种洗脱条件剧烈的Protein A 柱结合的重组蛋白质A一般具有5个串联结构域：E、D、A、B、C。这种重组蛋白A虽然除去了不重要的非结合域，仅由5个结构域组成，每个域均可以和IgG的Fc段结合，但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一，而且经常需要较低的pH值。如果减少串联结构域的个数，并且采取同型结构域串联，就可以避免不同结构域与抗体Fc 段亲和性的差异，洗脱条件会温和而均一。为此，我们可以做一个试验，比较一下这两种蛋白质A柱纯化的结果。
待纯化样品：人血清
实验材料：
GE公司的rProtein A Sepharose FF（E、D、A、B、C结构域串联）
Putus公司的rProtein A Sepharose FF（3个B结构域串联）
实验方法：
分别按照每个公司的说明书来操作，洗脱条件分别为pH值3.0和4.5， SDS-PAGE检测结果如下：。
Lane 1 Marker
[img][/img]Protein A 柱之进化

Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。因而，将Protein A 与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可制备用于抗体纯化的亲和填料。

早期的Protein A柱结合的都是天然Protein A。天然Protein A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成，分子量约42KD，结构如图1所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量的lgG。但同时，天然Protein A的其他非结合域会和非目标蛋白结合，这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够，会影响到后续的试验。

为了解决这些问题，科学家们运用基因工程技术，克隆出Protein A的基因，并对其进行改造，除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组Protein A的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中，的确是提高了产物的纯度。目前，市场上绝大部分重组Protein A柱都是这种产品。但是，纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液，如果洗脱效果不是很理想，还要降低pH，采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见，此法洗脱条件比较剧烈，最后收集的蛋白质很有可能变性，或者是复性困难。

这种洗脱条件剧烈的Protein A 柱结合的重组蛋白质A一般具有5个串联结构域：E、D、A、B、C。这种重组蛋白A虽然除去了不重要的非结合域，仅由5个结构域组成，每个域均可以和IgG的Fc段结合，但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一，而且经常需要较低的pH值。如果减少串联结构域的个数，并且采取同型结构域串联，就可以避免不同结构域与抗体Fc 段亲和性的差异，洗脱条件会温和而均一。为此，我们可以做一个试验，比较一下这两种蛋白质A柱纯化的结果。
待纯化样品：人血清
实验材料：
GE公司的rProtein A Sepharose FF（E、D、A、B、C结构域串联）
Putus公司的rProtein A Sepharose FF（3个B结构域串联）
实验方法：
分别按照每个公司的说明书来操作，洗脱条件分别为pH值3.0和4.5， SDS-PAGE检测结果如下：。
Lane 1 Marker
[img][/img]
SDS-PAGE Result of Human Serum Purification

上图从左边起，1、2、3号孔点的是经过Putus填料洗脱后稀释不同浓度抗体，4、5、6号孔点的是经过GE填料洗脱后稀释不同浓度抗体。7号孔点的是上柱后穿流人血清。8号孔点的是上柱前人血清。9号孔点的是Marker。

从图中，我们可以看出，与GE公司rProtein A Sepharose FF填料从人血清纯化抗体纯度比较，Putus填料纯化的抗体纯度更高。更重要的是，后者的洗脱条件仅为4.5，高于前者的洗脱条件3.4。使用具备较少B结构域的Protein A柱能获得高纯度的IgG，并且洗脱条件温和，对蛋白质的损伤小。