《Science》蛋白芯片的曙光
丁香园论坛
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迄今为止，蛋白阵列（protein arrays）主要有两种形式：一种是抗体阵列（antibody arrays），利用阵列上的抗体识别样品中的蛋白或其他分子；另一种则是我们今天要谈到的靶蛋白阵列（target protein arrays），通过阵列上的蛋白检测这些我们感兴趣的蛋白和其他分子，如药物、抗体、核酸、脂类或其他蛋白的作用。由于有高通量的优点，蛋白阵列是研究蛋白功能的好工具。但是，通常的靶蛋白阵列生产方式是分别得到不同的蛋白，纯化后再借助各种化学连接将它们点样到阵列上。这样的方式面临面临两个难题：一个是如何高通量的产生和纯化各种蛋白；另一个是如何保持蛋白在点样后的稳定性。虽然这种方式已经证明可行，不过这些技术上的难题却导致其难以广泛地被采用。
最新的一期《Science》（July 2，2004）报道了Harvard Medical School的科学家制作蛋白芯片的新方法，能够使其更实用：研究者将编码经过抗原决定簇标记的靶蛋白（epitope-tagged target proteins）的cDNA印记在玻璃载片上，然后利用无细胞的系统表达蛋白，再利用抗原决定簇标记进行原位固定。这种方法既不需要对不同的蛋白分别进行表达和纯化，又可以在使用前才产生蛋白，从而解决了保持蛋白稳定的难题。具体说，为了既能够附着DNA，又能够保持DNA的构向以利于转录和翻译，研究者利用紫外线将补骨脂素－生物素（psoralen-biotin）和DNA表达质粒接合在一起。而且，每一个被表达的蛋白的碳端都标记了一个谷胱甘肽S- 转移酶(Glutathione S-transferase，GST)，能够通过和预先印记在表达质粒旁边的GST抗体作用，从而使表达的蛋白固定在阵列上。
那这种核酸可编程性蛋白阵列（nucleic acid programmable protein array, NAPPA）到底能不能满足高通量的检测要求呢？研究者利用这项新技术检测了29个人类DNA复制起始蛋白的两两互作。其中，特别研究了复制许可因子Cdt1和特定蛋白的结合的调控。甚至还对Cdt1和另一蛋白Geminin结合所需的结构域进行了精细的作图。
不过像其他的高通量的研究手段，NAPPA也有美中不足：首先，体外转录翻译系统中可能存在一些桥梁蛋白和抑制因子可能影响结果的准确；其次，多肽标记（peptide tag）的使用，可能会因为空间效应影响蛋白的结合区而使蛋白无法结合；最后，NAPPA的蛋白体外表达系统缺乏后翻译的修饰（posttranslational modification），也会因为无法满足体内蛋白表达的时间和空间的分隔，导致蛋白的折叠和活性的变化。无论如何，NAPPA的出现，给生产蛋白芯片提供了更多的途径，是一个令人鼓舞的重大突破。
Science, Vol 305, Issue 5680, 86-90 , 2 July 2004
Self-Assembling Protein Microarrays
Niroshan Ramachandran,1 Eugenie Hainsworth,1,2 Bhupinder Bhullar,1 Samuel Eisenstein,1 Benjamin Rosen,1 Albert Y. Lau,1 Johannes C. Walter,3 Joshua LaBaerundefined
Protein microarrays provide a powerful tool for the study of protein function. However, they are not widely used, in part because of the challenges in producing proteins to spot on the arrays. We generated protein microarrays by printing complementary DNAs onto glass slides and then translating target proteins with mammalian reticulocyte lysate. Epitope tags fused to the proteins allowed them to be immobilized in situ. This obviated the need to purify proteins, avoided protein stability problems during storage, and captured sufficient protein for functional studies. We used the technology to map pairwise interactions among 29 human DNA replication initiation proteins, recapitulate the regulation of Cdt1 binding to select replication proteins, and map its geminin-binding domain.
1 Harvard Institute of Proteomics, Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School, 320 Charles Street, Cambridge, MA 02141, USA.
2 Technology and Engineering Center, Harvard Medical School, 240 Long-wood Avenue, Boston, MA 02115, USA.
3 Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School, 240 Long-wood Avenue, Boston, MA 02115, USA.
~undefined To whom correspondence should be addressed. E-mail: josh@hms.harvard.edu
全文链接:http://www.sciencemag.org/cgi/reprint/305/5680/86.pdf
最新的一期《Science》（July 2，2004）报道了Harvard Medical School的科学家制作蛋白芯片的新方法，能够使其更实用：研究者将编码经过抗原决定簇标记的靶蛋白（epitope-tagged target proteins）的cDNA印记在玻璃载片上，然后利用无细胞的系统表达蛋白，再利用抗原决定簇标记进行原位固定。这种方法既不需要对不同的蛋白分别进行表达和纯化，又可以在使用前才产生蛋白，从而解决了保持蛋白稳定的难题。具体说，为了既能够附着DNA，又能够保持DNA的构向以利于转录和翻译，研究者利用紫外线将补骨脂素－生物素（psoralen-biotin）和DNA表达质粒接合在一起。而且，每一个被表达的蛋白的碳端都标记了一个谷胱甘肽S- 转移酶(Glutathione S-transferase，GST)，能够通过和预先印记在表达质粒旁边的GST抗体作用，从而使表达的蛋白固定在阵列上。
那这种核酸可编程性蛋白阵列（nucleic acid programmable protein array, NAPPA）到底能不能满足高通量的检测要求呢？研究者利用这项新技术检测了29个人类DNA复制起始蛋白的两两互作。其中，特别研究了复制许可因子Cdt1和特定蛋白的结合的调控。甚至还对Cdt1和另一蛋白Geminin结合所需的结构域进行了精细的作图。
不过像其他的高通量的研究手段，NAPPA也有美中不足：首先，体外转录翻译系统中可能存在一些桥梁蛋白和抑制因子可能影响结果的准确；其次，多肽标记（peptide tag）的使用，可能会因为空间效应影响蛋白的结合区而使蛋白无法结合；最后，NAPPA的蛋白体外表达系统缺乏后翻译的修饰（posttranslational modification），也会因为无法满足体内蛋白表达的时间和空间的分隔，导致蛋白的折叠和活性的变化。无论如何，NAPPA的出现，给生产蛋白芯片提供了更多的途径，是一个令人鼓舞的重大突破。
Science, Vol 305, Issue 5680, 86-90 , 2 July 2004
Self-Assembling Protein Microarrays
Niroshan Ramachandran,1 Eugenie Hainsworth,1,2 Bhupinder Bhullar,1 Samuel Eisenstein,1 Benjamin Rosen,1 Albert Y. Lau,1 Johannes C. Walter,3 Joshua LaBaerundefined
Protein microarrays provide a powerful tool for the study of protein function. However, they are not widely used, in part because of the challenges in producing proteins to spot on the arrays. We generated protein microarrays by printing complementary DNAs onto glass slides and then translating target proteins with mammalian reticulocyte lysate. Epitope tags fused to the proteins allowed them to be immobilized in situ. This obviated the need to purify proteins, avoided protein stability problems during storage, and captured sufficient protein for functional studies. We used the technology to map pairwise interactions among 29 human DNA replication initiation proteins, recapitulate the regulation of Cdt1 binding to select replication proteins, and map its geminin-binding domain.
1 Harvard Institute of Proteomics, Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School, 320 Charles Street, Cambridge, MA 02141, USA.
2 Technology and Engineering Center, Harvard Medical School, 240 Long-wood Avenue, Boston, MA 02115, USA.
3 Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School, 240 Long-wood Avenue, Boston, MA 02115, USA.
~undefined To whom correspondence should be addressed. E-mail: josh@hms.harvard.edu
全文链接:http://www.sciencemag.org/cgi/reprint/305/5680/86.pdf
