【资源】双向电泳IPG（summer）操作总结
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一、样品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法
（1） 在液氮中研磨叶片
（2） 加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1 小时）弃上清。
（3） 加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
（4） 上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
（5） 用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
二、一向电泳（13cm的holder）
（1） 取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl
（2） 将上述溶液加到holder 的两个电极之间。
（3） 去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。
（4） 在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。
（5） 将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。
（6） 设置仪器的运行参数：
三、胶条的平衡（由一向到二向）
（1） 将胶条放入10ml 平衡缓冲液中（加入10mgDTT）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。
（2） 将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。
（3） 用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。
四、二向电泳
（1） 将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳.
（2） 设置仪器的运行参数：
五、平板胶的染色
硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）
（1） 固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去离子水，60 分钟。
（2） 敏化：75ml甲醇，0.5（1.57g五水硫代硫酸钠）g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水=====至250ml，30分钟。
（3） 清洗：用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。
（4） 银染：0.625g硝酸银，250ml去离子水，（使用之前配制）20 分钟。
（5） 显色：6.25g碳酸钠，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml 去离子水。
（6） 终止：5%的醋酸(EDTA 3.65g加超纯水至250ml)。 =====凝胶保存于1%乙酸中
（7） 照相分析。
（8） 保存制作干胶。
药品：
提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。
平衡缓冲液：1.5MTris－Cl ph8.8 6.7ml，尿素72.07g ，87％的甘油69ml，SDS 4g，溴酚蓝少许。溶涨液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚蓝少许溶于无菌水中，总体积为25ml。使用之前再加入IPG缓冲液0.5vl/100vl，DTT1.5vl/100vl。
制作平板胶：
分离胶的配制方法： 12%
药品/浓度 5％ 7.5％ 10％ 12.5% 15%
丙烯酰胺 6.7ml 10ml 13.3ml 16.7ml 20ml
分离胶缓冲液 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml
10×SDS 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml
无菌水 22.7ml 19.4ml 16.1ml 12.8ml 9.5ml
10％过硫酸胺 200vl 200vl 200vl 200vl 200vl
TEMEundefined 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl
~undefined在灌胶之前加入
药品配制：
丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液：Trisbase181.5g 溶于750ml 无菌水中调PH8.8总体积1000ml10％SDS：SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10％的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS 电泳缓冲液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml
封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许
附：蛋白质含量测定的方法（Bradford 方法）
原理：这一方法基于2 考马斯亮蓝G－250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465－595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的 大小计算蛋白的含量。
溶液：
1）Bradford储存液
100ml95％乙醇
200ml88％磷酸
350mgServaG蓝
室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液
425ml双蒸水
15ml95％乙醇
30ml88％磷酸
30ml Bradford储存液
用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）
做标准曲线：
取样品即可测量。
注意事项：
1、样品制备，样品制备是做好2-d 的关键，样品中离子浓度不能过大，最好用新鲜的样品提取蛋白质，如果不确定蛋白提取情况，建议先跑sds-page检验。
2、上样量的问题， ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择，根据不同样品选择不同pH值，
4、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度需调整。
（1） 在液氮中研磨叶片
（2） 加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1 小时）弃上清。
（3） 加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
（4） 上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
（5） 用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
二、一向电泳（13cm的holder）
（1） 取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl
（2） 将上述溶液加到holder 的两个电极之间。
（3） 去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。
（4） 在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。
（5） 将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。
（6） 设置仪器的运行参数：
三、胶条的平衡（由一向到二向）
（1） 将胶条放入10ml 平衡缓冲液中（加入10mgDTT）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。
（2） 将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。
（3） 用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。
四、二向电泳
（1） 将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳.
（2） 设置仪器的运行参数：
五、平板胶的染色
硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）
（1） 固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去离子水，60 分钟。
（2） 敏化：75ml甲醇，0.5（1.57g五水硫代硫酸钠）g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水=====至250ml，30分钟。
（3） 清洗：用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。
（4） 银染：0.625g硝酸银，250ml去离子水，（使用之前配制）20 分钟。
（5） 显色：6.25g碳酸钠，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml 去离子水。
（6） 终止：5%的醋酸(EDTA 3.65g加超纯水至250ml)。 =====凝胶保存于1%乙酸中
（7） 照相分析。
（8） 保存制作干胶。
药品：
提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。
平衡缓冲液：1.5MTris－Cl ph8.8 6.7ml，尿素72.07g ，87％的甘油69ml，SDS 4g，溴酚蓝少许。溶涨液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚蓝少许溶于无菌水中，总体积为25ml。使用之前再加入IPG缓冲液0.5vl/100vl，DTT1.5vl/100vl。
制作平板胶：
分离胶的配制方法： 12%
药品/浓度 5％ 7.5％ 10％ 12.5% 15%
丙烯酰胺 6.7ml 10ml 13.3ml 16.7ml 20ml
分离胶缓冲液 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml
10×SDS 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml
无菌水 22.7ml 19.4ml 16.1ml 12.8ml 9.5ml
10％过硫酸胺 200vl 200vl 200vl 200vl 200vl
TEMEundefined 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl
~undefined在灌胶之前加入
药品配制：
丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液：Trisbase181.5g 溶于750ml 无菌水中调PH8.8总体积1000ml10％SDS：SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10％的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS 电泳缓冲液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml
封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许
附：蛋白质含量测定的方法（Bradford 方法）
原理：这一方法基于2 考马斯亮蓝G－250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465－595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的 大小计算蛋白的含量。
溶液：
1）Bradford储存液
100ml95％乙醇
200ml88％磷酸
350mgServaG蓝
室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液
425ml双蒸水
15ml95％乙醇
30ml88％磷酸
30ml Bradford储存液
用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）
做标准曲线：
取样品即可测量。
注意事项：
1、样品制备，样品制备是做好2-d 的关键，样品中离子浓度不能过大，最好用新鲜的样品提取蛋白质，如果不确定蛋白提取情况，建议先跑sds-page检验。
2、上样量的问题， ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择，根据不同样品选择不同pH值，
4、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度需调整。
