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【共享】题录集:静脉大容量快速注射siRNA或质粒

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题录集:静脉大容量快速注射siRNA或质粒

有些老师曾经认为通过小鼠尾静脉注射200微升质粒液体都很困难。而现在,小鼠尾静脉注射1.3毫升的siRNA或质粒已经快成了在整体动物水平快速鉴定某个基因功能的标准手段。这种大容量快速注射还可以用于兔子、狗等大型动物。

除了尾静脉是可以输入核酸的路径之外,还可以通过门静脉、肾静脉、下肢静脉等进行局部灌注。所以,以前用于反义核酸(ODN)的一些体内delivery手段,还可以拿来尝试用于RNAi的核酸输入。

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在啮齿类动物建立尾静脉大容量快速注射方法(也有译为“尾静脉液压注射法”):

1. Liu F, Song Y, Liu D. 1999. Hydrodynamics-based Transfection in Animals by Systemic Administration of Plasmid DNA. Gene Therapy 6:1258-1266.
2. Zhang G, Budker V and Wolff JA. 1999. High Levels of Foreign Gene Expression in Hepatocytes after Tail Vein Injections of Naked Plasmid DNA. Human Gene Therapy 10:1735-1737.
3. Maruyama H, et al. 2004. Rat liver-targeted naked plasmid DNA transfer by tail vein injection. Mol Biotechnol. 26:165-72.

大容量快速注射法也可用于较大型动物:

1. Eastman SJ, et al. 2002. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Human Gene Therapy. 13:2065-77.
2. Zhang, G., D. Vargo, et al. (1997). Expression of naked plasmid DNA injected into the afferent and efferent vessels of rodent and dog livers. Human Gene Therapy 8:1763-72.

尾静脉大容量快速注射法用于体内转染siRNA:

1. Chabicovsky M, Herkner K, Rossmanith W.2003. Overexpression of activin beta(C) or activin beta(E) in the mouse liver inhibits regenerative deoxyribonucleic acid synthesis of hepatic cells. Endocrinology. 144:3497-504
2. Chang J, Sigal LJ, Lerro A, Taylor J. 2001.Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75:3469-73.
3. Giladi H, et al. 2003. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Molecular Therapy. 8:769-76.
4. Klein C, et al. 2003. Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA. Gastroenterology. 125:9-18.
5. Kobayashi N, Matsui Y, Kawase A, Hirata K, Miyagishi M, Taira K, Nishikawa M, Takakura Y. 2004. Vectorbased in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308:688-93.
6. Lewis, D. L., J. E. Hagstrom, et al. .2002. Efficient Delivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice. Nature Genetics 32: 107-8.
7. McCaffrey, A. P., L. Meuse, et al. 2002. RNA interference in adult mice. Nature 418(6893): 38-9.
8. McCaffrey, A. P., H. Nakai, et al. 2003. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nature Biotechnology 21(6): 639-44.
9. Song, E., S. K. Lee, et al. (2003). RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nature Medicine 9(3): 347-51.
10. Yang PL, et al. 2002. Hydrodynamic injection of viral DNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection. Proc Natl Acad Sci USA. 99:13825-30.
11. Zender, L., S. Hutker, et al. 2003. Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice. Proc Natl Acad Sci USA 100(13): 7797-802.

国内有多篇应用尾静脉大容量注射法传输质粒等载体,较早应用的有以下两篇:

金振晓,刘维永,等.人甘露糖结合凝集素在小鼠肝脏细胞内表达.中国免疫学杂志. 2002.018(012):828-831.
第四军医大学西京医院心血管外科中心,西安710032
[文摘] 目的:在小鼠肝脏组织中表达人甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)。方法:采用PCR方法从pGEMT-MBL质粒中扩增人MBLcDNA序列,克隆人pUC19载体中,限制性酶切鉴定及测序正确后,将MBLcDNA克隆人真核表达载体pcDNA3质粒中,构建成pcDNA3-MBL质粒,经尾静脉大容量快速注射pcDNA3-MBL质粒20μg,8h后处死小鼠,Western Blot方法检测小鼠肝脏组织和血清中人MBL,免疫组织化学方法检测小鼠肝脏组织中人MBL的表达情况。结果:成功扩增出人MBLcDNA序列并构建克隆载体pUC19-MBL,测序结果正确,成功构建pcDNA3-MBL真核表达载体。小鼠尾静脉注射pcDNA3-MBL质粒后8h,免疫组化检测证实肝细胞中有人MBL表达,Western blot方法检测发现血清和肝脏组织中出现人MBL蛋白。结论:真核表达载体pcDNA3-MBL裸质粒DNA静脉注射可以在小鼠肝脏中大量表达人MBL,并分泌人血,为临床纠正先天性低MBL患者的易感染状态提供了新的思路。

贺晨霞 吴文君 等. 尾静脉大容量快速注射法介导的人凝血因子Ⅸ基因在小鼠肝内的高效表达. 科学通报.2003.048(005).-447-451
复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室,上海200433
[摘要] 尾静脉大容量快速注射裸质粒DNA能够介导外源基因在动物肝内高效表达,采用此方法将人凝血因子Ⅸ(hFIX)表达质粒pCMV-hFIX 2.2mL于7s内导入小鼠体内,hFIX在小鼠体内表达水平最高为2921ng/mL(血浆)。hFIX表达水平与裸质粒DNA注射剂量呈正相关,重复注射的hFIX表达水平偏低(最高1459ng/mL)。PCR检测发现小鼠多种器官中存在hFIX cDNA,RT-PCR和免疫组化切片检测表明,hFIX mRNA和蛋白主要在肝脏中表达。转氨酶水平与病理切片检测表明,注射1d后5%的肝脏细胞受到损伤,但在3-10d内恢复。研究结果表明,尾静脉大容量快速注射法能够介导hFIX在小鼠体内高水平表达,为基因治疗研究提供了一项简便而实用的动物实验手段。
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