rnai 的一篇综述（中文）
丁香园论坛
3699
RNAi介绍
1. RNAi现象
RNA 干涉（或者叫做RNA干扰）指的是细胞内由双链RNA诱导降解与其配对的特定mRNA的过程。在一些生物系统中，少量拷贝的双链RNA能导致细胞内所有同源基因的降解。这个现象在进化过程中保守而且广泛，许多基因在这个过程中发挥了重要的作用。 人们发现这个现象在线虫、昆虫、哺乳动物、植物和真菌中广泛存在。而在RNAi现象在线虫中发现之前，其机制被认为是一种转录后基因沉默，共抑制或者是压制，被认为是细胞防御中由双链RNA区域来区别和对抗病毒和不稳定的染色体部位。
由长链RNA发动的RNAi现象，中间体是一种小的干扰RNA，通常为21－23个碱基长。当人们尝试分离这样的SiRNA时才发现细胞基因组中有大量的类似小RNA的编码。这些小RNA，大约21－23个碱基长，被统一称作卫星RNA。（mirna） RNAi机制过程中首先被鉴定出来是一种被称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一种。Dicer能将长的双链RNA通过切割的方式降解为 SIRNA,也是在对70碱基的转录的未完成发卡结构降解成mirna的方式。卫星RNA随后被科研人员认为是RNAi相关的复合体和SiRNA共享一条通路。和RNAi过程相关的蛋白因子相同， miRNA的存在不局限于生物的种类，从低等到高等的真核生物都有发现。特别引人注意的是miRNA的研究使得RNAi相关的通过调节基因表达实现功能相似的转录调节核组织特异性的剪接控制。
2. RNAi 的机制
发卡状的 miRNA先导体或者是长的双链RNA先被Dicer切割称21－23 个碱基对的siRNA（图一）。一旦产生（或者是人工转染产生）siRNA（小干涉RNA） 触发形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）经过一些过渡期，开始被活化。同时， 复合物中双链RNA被螺旋酶无损伤的解螺旋， 形成单链RNA（SSRNA）为下一步做好准备。一旦单链RNA同目的mRNA配对，核酸酶被活化，在复合物内部降解mRNA。
Figure 1: RNAi related pathways (modified and redrawn from McManus and Sharp 2002)
图一：RNAi 相关通路
在不同物种之间的RNAi途径中，有两种蛋白是高度保守的。一种是起始阶段的Dicer酶， 另一种蛋白是一个蛋白家族，Argonatute 蛋白。这些蛋白都有一些相同的保守区域， 几乎所有在发育和其它的胞内过程中如干细胞的维持和肿瘤细胞的发生中都有一定的功能。对RNAi机制的进一步研究毫无疑问在生物学的许多领域都将提供全新的令人着迷的信息。
3. RNAi作为工具
抑制基因的表达能提供给研究者关于基因功能的信息。它能从两个层面上得以实现，一是在蛋白水平上通过特别的抑制子抑制蛋白功能，或者在RNA水平上通过阻止mRNA转录成蛋白来实现。传统的RNA水平抑制包括了反义寡聚核甘酸技术和核酶技术。这些抑制基因表达的手段也为人类疾病提供了一种潜在的治疗手段。1998年Frie发现RNAi现象后，很快科研人员开始用双链RNA作为抑制目的基表达的试剂。典型的RNAi技术对于反义技术有着特别的优势，它对基本上任何mRNA系列都有着非常高的成功率。
然而，直到最近，RNAi技术在大多哺乳动物系统中还是很不成功，主要是因为长双链RNA导入抑制基因表达被哺乳动物的抗病毒系统包括pKR和干挠素所影响。最近Elbashir等人和其它的研究者给我们展示了一种利用21－23个双链RNA绕过通常的阻碍的特殊的基因沉默技术。 这种双链RNA由于其小于30bp将不会引起PKR系统的活化。
4.在哺乳动物细胞中产生的RNAi反应的试剂
有许多不同的试剂都可能在细胞中产生RNAi效应。 除了我们的 链状沉寂基于DNA方法外，还有各种形式的RNA或者环状质粒。直接用RNA的方法的问题包括了费用，稳定性和很难在细胞内维持高拷贝数量的。质粒DNA在另一方面是很难变化，包括克隆，因此不适合用于做高拷贝的应用。我们居于DNA的线状沉寂RNAi技术，克服了以上的许多困难，我们将在底下详细的叙述。由于转染这些分子进入细胞可行性增加了我们的技术在研究和药物发展领域的应用。
RNA试剂:
合成的siRNA，化学合成，纯化，退火的21－23个 碱基RNA 寡聚物 ，并直接转染进入培养的细胞（例如，图三，最后一个图，section C 的初步研究） RNA 寡聚物比DNA寡聚物要贵的多。
转录的siRNA：在体外用T7（或者其它）的聚合酶转录短的21－23个碱基的RNA，并同DNA模板分离，退火。在这个过程中，对于T7启动子必须的额外的碱基必须在下一步的清除过程中用RNA酶消化。Ambion公司提供了此种试剂盒。同合成siRNA相比，每单位数量siRNA的费用会相对较低。
产生siRNA：长链的先导RNA被一种重组的RNA酶III或者Dicer所降解形成siRNA。
体外转录的正义或者反义的长链RNA退火，然后切割成较短的双链RNA.同转录siRNA相比，过程现对简单耗时较短（一般只要几个小时到两天），但有可能导致同源基因也产生RNAi。其特异性不够令人满意。
通常情况下，由外源的双链RNA导致的RNAi，仅仅是一个短暂效应。此外，RNA分子是相当不稳定且易被环境中丰富的RNA酶所降解，因此处理RNA分子需要特别的小心。自然状态下的RNA分子用于治疗是相当不实用的。对核苷加保护性部分或是改变多聚核苷链的骨架能提高稳定性，并被用于某些的反义技术。然而，几种使RNA分子能更好的抗拒RNA酶降解的修饰在实验中都表现出减少RNAi的效应。用一条DNA链取代双链RNA中的一条，则基因沉寂效应完全不会发生。此外，合成RNA分子的费用很高而且过程单调而复杂。由于有着如上的种种限制，我们对不依赖于RNA分子做中介同时能在细胞或组织中永久产生基因沉寂的方法和材料有很大的兴趣。
相反的，DNA分子比RNA更稳定性,性价比也更高。DNA能完整的进入宿主细胞的基因组同时有着长期的效应。他们相对容易生产和使用。.
DNA模板：DNA分子能被用于在目标细胞中表达siRNA。
用DNA产生RNAi导致基因特异性沉默的关键在控制RNA表达的长度，也就是必须小于30个碱基，这样干挠素和PKR导致的宿主细胞的胞内保护性作用就不起作用。在哺乳动物的RNA聚合酶中，pol III 通过终止子停止转录，停止RNA的延长。同时 pol III 启动子的使用 能有效的 在哺乳动物细胞内产生siRNA， 例如， 一种 H 1－RNA启动子， 一种 pol III 的三级启动子， 被用于质粒载体直接转录短的发卡状RNA随后进入细胞产生SiRNA。同样地，pol III 的 U6 启动子 也被用做产生短发卡状RNA或者正义和反义的 SiRNA。
短的发卡状RNA能摹拟自然状态产生 miRNA。然而，目前的关于设计和产生这样人工的短的发卡RNA来产生RNAi的数据依然没有统一的。 例如， 发卡环状部分的大小（例如说长于7个核苷）和序列在一个报告中被发现是非常重要的， 同时环较短（1，4，6个核苷）被其它人成功的应用。
一些报告中认为基因沉寂效应依赖于发卡正义或者是反义链的顺序或者方向性，但是在其它报告中它是相对不重要或者是不相关的。当这这些研究中大多的发卡被设计成同茎环有一个很好的配对时，一个报告表面不配对的茎，例如那些在miRNA中的情况， 也许对于RNAi有着很重要的影响。
在所有研究中利用短的 Pol III 的classIII的启动子和它简单的终止子都能产生高拷贝数量的短转录片断。然而一个简单的自然终止子不足以将所有转录在想要的地方停止。 这样的设计中，我们可以观察到转录有可能非特异性的终止。相关，Pol II 所有转录终端有polyA的尾部， 在一篇文章中导致了RNAi的失败。但是在另一篇文章中却表现的很好（有修饰过的ployA）。
绿阳生物技术公司，在所有其它相关出版物之前，我们研究出了一种DNA基础上的RNAi技术专利。而我们的设计能在哺乳动物细有效的产生siRNA或SHRNA.
我们初步的数据表明, 21-23个碱基在诱导产生RNAi方面比24－25个碱基有效的多。这表明了控制siRNA在21－23个碱基长是基于DNA的RNAi有效使基因沉寂的关键。同大多数发表的文章里的设计不同，我们的DNA试剂盒能在最理想的Pol III启动子下转录出21－23个碱基的siRNA，而不像他们还有连接或者是限制性内切酶留下的额外碱基。
Linesilence 试剂盒
我们设计的DNA表达试剂盒能在我们自己设计的Pol III启动子下，用双终止子机制下持续产生RNAi 。这些设计我们称做linesilence 试剂盒。在大多数文章方法还在用run－off 机制时，还在双链DNA上留有额外的碱基时，我们已经能保证RNA的精确的开始和准确的结束
假如用户需要双终止子的盒状结构也可以被连接进一个环状的载体。我们已经将双终止子的盒状结果放进了原核和真核的一个质粒形式（psilencircle ）. 目前我们正尝试着将双终止子的结构放入病毒载体。
Figure 2: Schematic of Allele LineSilence™ DNA Cassette
通过pcr来产生正义和反义的linesilence 结构，其pcr上游引物相同，而下游引物由特异的目标序列而决定。两种终止子的试剂盒 都可以被用来诱导RNAi效应的产生。
用这个技术，我们已经在几个细胞系中测试了许多目标基因的RNAI效应。图三表现的时 egfp 被敲除
图四时为Dsred 被敲除。
Control Sense Antisense Both cassettes (a/s) siRNAs LineSilence LineSilence LineSilence
Figure 3: LineSilence reagents reduce GFP expression. Human 293 cells were transfected with 3 pmol of PCR product of sense, antisense each, or both using RNAi Shuttle, which can effectively transfect both DNA and RNA. For comparison, 45 pmol of siRNAs were used. Cells were observed 24 hours after transfection. (Magnifications: x40, Gain: 1,500)
Figure 4: LineSilence reagents reduce dsRED expression. Experiments were done similar to those in Figure 3. Left, untreated cells; right, cells trasfected with LineSilence a/s against dsRed.
Literature Cited
1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature 391, 806-11.
2. Hannon, G. J. (2002). RNA interference, Nature 418, 244-51.
3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001). Identification of novel genes coding for small expressed RNAs, Science 294, 853-8.
4. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., and Bartel, D. P. (2001). An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans, Science 294, 858-62.
5. Lee, R. C., and Ambros, V. (2001). An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans, Science 294, 862-4.
6. Provost, P., Dishart, D., Doucet, J., Frendewey, D., Samuelsson, B., and Radmark, O. (2002). Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer, Embo J 21, 5864-74.
7. Zhang, H., Kolb, F. A., Brondani, V., Billy, E., and Filipowicz, W. (2002). Human Dicer preferentially cleaves dsRNAs at their termini without a requirement for ATP, Embo J 21, 5875-85.
8. Hutvagner, G., and Zamore, P. D. (2002). A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex, Science 297, 2056-60.
9. Dennis, C. (2002). The brave new world of RNA, Nature 418, 122-4.
10. McManus, M. T., and Sharp, P. A. (2002). Gene silencing in mammals by small interfering RNAs, Nat Rev Genet 3, 737-47.
11. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., and Hannon, G. J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference, Nature 409, 363-6.
12. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., and Hannon, G. J. (2002). The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis, Genes Dev 16, 2733-42.
13. Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature 411, 494-8.
14. Donze, O., and Picard, D. (2002). RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase, Nucleic Acids Res 30, e46.
15. Yang, D., Buchholz, F., Huang, Z., Goga, A., Chen, C. Y., Brodsky, F. M., and Bishop, J. M. (2002). Short RNA duplexes produced by hydrolysis with Escherichia coli RNase III mediate effective RNA interference in mammalian cells, Proc Natl Acad Sci U S A 99, 9942-7.
16. Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., and Fire, A. (2000). Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference, Mol Cell 6, 1077-87.
17. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., and Agami, R. (2002). A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells, Science 296, 550-3.
18. Sui, G., Soohoo, C., Affar el, B., Gay, F., Shi, Y., and Forrester, W. C. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells, Proc Natl Acad Sci U S A 99, 5515-20.
19. Miyagishi, M., and Taira, K. (2002). U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells, Nat Biotechnol 20, 497-500.
20. Lee, N. S., Dohjima, T., Bauer, G., Li, H., Li, M. J., Ehsani, A., Salvaterra, P., and Rossi, J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells, Nat Biotechnol 20, 500-5.
21. Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., and Engelke, D. R. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells, Nat Biotechnol 20, 505-8.
22. Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., and Conklin, D. S. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells, Genes Dev 16, 948-58.
23. Tuschl, T. (2002). Expanding small RNA interference, Nat Biotechnol 20, 446-8.
24. McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., and Sharp, P. A. (2002). Gene silencing using micro-RNA designed hairpins, Rna 8, 842-50.
25. Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., and Davidson, B. L. (2002). siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo, Nat Biotechnol 20, 1006-10.
1. RNAi现象
RNA 干涉（或者叫做RNA干扰）指的是细胞内由双链RNA诱导降解与其配对的特定mRNA的过程。在一些生物系统中，少量拷贝的双链RNA能导致细胞内所有同源基因的降解。这个现象在进化过程中保守而且广泛，许多基因在这个过程中发挥了重要的作用。 人们发现这个现象在线虫、昆虫、哺乳动物、植物和真菌中广泛存在。而在RNAi现象在线虫中发现之前，其机制被认为是一种转录后基因沉默，共抑制或者是压制，被认为是细胞防御中由双链RNA区域来区别和对抗病毒和不稳定的染色体部位。
由长链RNA发动的RNAi现象，中间体是一种小的干扰RNA，通常为21－23个碱基长。当人们尝试分离这样的SiRNA时才发现细胞基因组中有大量的类似小RNA的编码。这些小RNA，大约21－23个碱基长，被统一称作卫星RNA。（mirna） RNAi机制过程中首先被鉴定出来是一种被称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一种。Dicer能将长的双链RNA通过切割的方式降解为 SIRNA,也是在对70碱基的转录的未完成发卡结构降解成mirna的方式。卫星RNA随后被科研人员认为是RNAi相关的复合体和SiRNA共享一条通路。和RNAi过程相关的蛋白因子相同， miRNA的存在不局限于生物的种类，从低等到高等的真核生物都有发现。特别引人注意的是miRNA的研究使得RNAi相关的通过调节基因表达实现功能相似的转录调节核组织特异性的剪接控制。
2. RNAi 的机制
发卡状的 miRNA先导体或者是长的双链RNA先被Dicer切割称21－23 个碱基对的siRNA（图一）。一旦产生（或者是人工转染产生）siRNA（小干涉RNA） 触发形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）经过一些过渡期，开始被活化。同时， 复合物中双链RNA被螺旋酶无损伤的解螺旋， 形成单链RNA（SSRNA）为下一步做好准备。一旦单链RNA同目的mRNA配对，核酸酶被活化，在复合物内部降解mRNA。
Figure 1: RNAi related pathways (modified and redrawn from McManus and Sharp 2002)
图一：RNAi 相关通路
在不同物种之间的RNAi途径中，有两种蛋白是高度保守的。一种是起始阶段的Dicer酶， 另一种蛋白是一个蛋白家族，Argonatute 蛋白。这些蛋白都有一些相同的保守区域， 几乎所有在发育和其它的胞内过程中如干细胞的维持和肿瘤细胞的发生中都有一定的功能。对RNAi机制的进一步研究毫无疑问在生物学的许多领域都将提供全新的令人着迷的信息。
3. RNAi作为工具
抑制基因的表达能提供给研究者关于基因功能的信息。它能从两个层面上得以实现，一是在蛋白水平上通过特别的抑制子抑制蛋白功能，或者在RNA水平上通过阻止mRNA转录成蛋白来实现。传统的RNA水平抑制包括了反义寡聚核甘酸技术和核酶技术。这些抑制基因表达的手段也为人类疾病提供了一种潜在的治疗手段。1998年Frie发现RNAi现象后，很快科研人员开始用双链RNA作为抑制目的基表达的试剂。典型的RNAi技术对于反义技术有着特别的优势，它对基本上任何mRNA系列都有着非常高的成功率。
然而，直到最近，RNAi技术在大多哺乳动物系统中还是很不成功，主要是因为长双链RNA导入抑制基因表达被哺乳动物的抗病毒系统包括pKR和干挠素所影响。最近Elbashir等人和其它的研究者给我们展示了一种利用21－23个双链RNA绕过通常的阻碍的特殊的基因沉默技术。 这种双链RNA由于其小于30bp将不会引起PKR系统的活化。
4.在哺乳动物细胞中产生的RNAi反应的试剂
有许多不同的试剂都可能在细胞中产生RNAi效应。 除了我们的 链状沉寂基于DNA方法外，还有各种形式的RNA或者环状质粒。直接用RNA的方法的问题包括了费用，稳定性和很难在细胞内维持高拷贝数量的。质粒DNA在另一方面是很难变化，包括克隆，因此不适合用于做高拷贝的应用。我们居于DNA的线状沉寂RNAi技术，克服了以上的许多困难，我们将在底下详细的叙述。由于转染这些分子进入细胞可行性增加了我们的技术在研究和药物发展领域的应用。
RNA试剂:
合成的siRNA，化学合成，纯化，退火的21－23个 碱基RNA 寡聚物 ，并直接转染进入培养的细胞（例如，图三，最后一个图，section C 的初步研究） RNA 寡聚物比DNA寡聚物要贵的多。
转录的siRNA：在体外用T7（或者其它）的聚合酶转录短的21－23个碱基的RNA，并同DNA模板分离，退火。在这个过程中，对于T7启动子必须的额外的碱基必须在下一步的清除过程中用RNA酶消化。Ambion公司提供了此种试剂盒。同合成siRNA相比，每单位数量siRNA的费用会相对较低。
产生siRNA：长链的先导RNA被一种重组的RNA酶III或者Dicer所降解形成siRNA。
体外转录的正义或者反义的长链RNA退火，然后切割成较短的双链RNA.同转录siRNA相比，过程现对简单耗时较短（一般只要几个小时到两天），但有可能导致同源基因也产生RNAi。其特异性不够令人满意。
通常情况下，由外源的双链RNA导致的RNAi，仅仅是一个短暂效应。此外，RNA分子是相当不稳定且易被环境中丰富的RNA酶所降解，因此处理RNA分子需要特别的小心。自然状态下的RNA分子用于治疗是相当不实用的。对核苷加保护性部分或是改变多聚核苷链的骨架能提高稳定性，并被用于某些的反义技术。然而，几种使RNA分子能更好的抗拒RNA酶降解的修饰在实验中都表现出减少RNAi的效应。用一条DNA链取代双链RNA中的一条，则基因沉寂效应完全不会发生。此外，合成RNA分子的费用很高而且过程单调而复杂。由于有着如上的种种限制，我们对不依赖于RNA分子做中介同时能在细胞或组织中永久产生基因沉寂的方法和材料有很大的兴趣。
相反的，DNA分子比RNA更稳定性,性价比也更高。DNA能完整的进入宿主细胞的基因组同时有着长期的效应。他们相对容易生产和使用。.
DNA模板：DNA分子能被用于在目标细胞中表达siRNA。
用DNA产生RNAi导致基因特异性沉默的关键在控制RNA表达的长度，也就是必须小于30个碱基，这样干挠素和PKR导致的宿主细胞的胞内保护性作用就不起作用。在哺乳动物的RNA聚合酶中，pol III 通过终止子停止转录，停止RNA的延长。同时 pol III 启动子的使用 能有效的 在哺乳动物细胞内产生siRNA， 例如， 一种 H 1－RNA启动子， 一种 pol III 的三级启动子， 被用于质粒载体直接转录短的发卡状RNA随后进入细胞产生SiRNA。同样地，pol III 的 U6 启动子 也被用做产生短发卡状RNA或者正义和反义的 SiRNA。
短的发卡状RNA能摹拟自然状态产生 miRNA。然而，目前的关于设计和产生这样人工的短的发卡RNA来产生RNAi的数据依然没有统一的。 例如， 发卡环状部分的大小（例如说长于7个核苷）和序列在一个报告中被发现是非常重要的， 同时环较短（1，4，6个核苷）被其它人成功的应用。
一些报告中认为基因沉寂效应依赖于发卡正义或者是反义链的顺序或者方向性，但是在其它报告中它是相对不重要或者是不相关的。当这这些研究中大多的发卡被设计成同茎环有一个很好的配对时，一个报告表面不配对的茎，例如那些在miRNA中的情况， 也许对于RNAi有着很重要的影响。
在所有研究中利用短的 Pol III 的classIII的启动子和它简单的终止子都能产生高拷贝数量的短转录片断。然而一个简单的自然终止子不足以将所有转录在想要的地方停止。 这样的设计中，我们可以观察到转录有可能非特异性的终止。相关，Pol II 所有转录终端有polyA的尾部， 在一篇文章中导致了RNAi的失败。但是在另一篇文章中却表现的很好（有修饰过的ployA）。
绿阳生物技术公司，在所有其它相关出版物之前，我们研究出了一种DNA基础上的RNAi技术专利。而我们的设计能在哺乳动物细有效的产生siRNA或SHRNA.
我们初步的数据表明, 21-23个碱基在诱导产生RNAi方面比24－25个碱基有效的多。这表明了控制siRNA在21－23个碱基长是基于DNA的RNAi有效使基因沉寂的关键。同大多数发表的文章里的设计不同，我们的DNA试剂盒能在最理想的Pol III启动子下转录出21－23个碱基的siRNA，而不像他们还有连接或者是限制性内切酶留下的额外碱基。
Linesilence 试剂盒
我们设计的DNA表达试剂盒能在我们自己设计的Pol III启动子下，用双终止子机制下持续产生RNAi 。这些设计我们称做linesilence 试剂盒。在大多数文章方法还在用run－off 机制时，还在双链DNA上留有额外的碱基时，我们已经能保证RNA的精确的开始和准确的结束
假如用户需要双终止子的盒状结构也可以被连接进一个环状的载体。我们已经将双终止子的盒状结果放进了原核和真核的一个质粒形式（psilencircle ）. 目前我们正尝试着将双终止子的结构放入病毒载体。
Figure 2: Schematic of Allele LineSilence™ DNA Cassette
通过pcr来产生正义和反义的linesilence 结构，其pcr上游引物相同，而下游引物由特异的目标序列而决定。两种终止子的试剂盒 都可以被用来诱导RNAi效应的产生。
用这个技术，我们已经在几个细胞系中测试了许多目标基因的RNAI效应。图三表现的时 egfp 被敲除
图四时为Dsred 被敲除。
Control Sense Antisense Both cassettes (a/s) siRNAs LineSilence LineSilence LineSilence
Figure 3: LineSilence reagents reduce GFP expression. Human 293 cells were transfected with 3 pmol of PCR product of sense, antisense each, or both using RNAi Shuttle, which can effectively transfect both DNA and RNA. For comparison, 45 pmol of siRNAs were used. Cells were observed 24 hours after transfection. (Magnifications: x40, Gain: 1,500)
Figure 4: LineSilence reagents reduce dsRED expression. Experiments were done similar to those in Figure 3. Left, untreated cells; right, cells trasfected with LineSilence a/s against dsRed.
Literature Cited
1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature 391, 806-11.
2. Hannon, G. J. (2002). RNA interference, Nature 418, 244-51.
3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001). Identification of novel genes coding for small expressed RNAs, Science 294, 853-8.
4. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., and Bartel, D. P. (2001). An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans, Science 294, 858-62.
5. Lee, R. C., and Ambros, V. (2001). An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans, Science 294, 862-4.
6. Provost, P., Dishart, D., Doucet, J., Frendewey, D., Samuelsson, B., and Radmark, O. (2002). Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer, Embo J 21, 5864-74.
7. Zhang, H., Kolb, F. A., Brondani, V., Billy, E., and Filipowicz, W. (2002). Human Dicer preferentially cleaves dsRNAs at their termini without a requirement for ATP, Embo J 21, 5875-85.
8. Hutvagner, G., and Zamore, P. D. (2002). A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex, Science 297, 2056-60.
9. Dennis, C. (2002). The brave new world of RNA, Nature 418, 122-4.
10. McManus, M. T., and Sharp, P. A. (2002). Gene silencing in mammals by small interfering RNAs, Nat Rev Genet 3, 737-47.
11. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., and Hannon, G. J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference, Nature 409, 363-6.
12. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., and Hannon, G. J. (2002). The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis, Genes Dev 16, 2733-42.
13. Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature 411, 494-8.
14. Donze, O., and Picard, D. (2002). RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase, Nucleic Acids Res 30, e46.
15. Yang, D., Buchholz, F., Huang, Z., Goga, A., Chen, C. Y., Brodsky, F. M., and Bishop, J. M. (2002). Short RNA duplexes produced by hydrolysis with Escherichia coli RNase III mediate effective RNA interference in mammalian cells, Proc Natl Acad Sci U S A 99, 9942-7.
16. Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., and Fire, A. (2000). Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference, Mol Cell 6, 1077-87.
17. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., and Agami, R. (2002). A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells, Science 296, 550-3.
18. Sui, G., Soohoo, C., Affar el, B., Gay, F., Shi, Y., and Forrester, W. C. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells, Proc Natl Acad Sci U S A 99, 5515-20.
19. Miyagishi, M., and Taira, K. (2002). U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells, Nat Biotechnol 20, 497-500.
20. Lee, N. S., Dohjima, T., Bauer, G., Li, H., Li, M. J., Ehsani, A., Salvaterra, P., and Rossi, J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells, Nat Biotechnol 20, 500-5.
21. Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., and Engelke, D. R. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells, Nat Biotechnol 20, 505-8.
22. Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., and Conklin, D. S. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells, Genes Dev 16, 948-58.
23. Tuschl, T. (2002). Expanding small RNA interference, Nat Biotechnol 20, 446-8.
24. McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., and Sharp, P. A. (2002). Gene silencing using micro-RNA designed hairpins, Rna 8, 842-50.
25. Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., and Davidson, B. L. (2002). siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo, Nat Biotechnol 20, 1006-10.
