【原创】【翻译】【共享】QIANGEN Plasmid Midi and Maxi Kits 试剂盒说明书
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俺开始做实验已经快两个月了，郁闷死了！！！
郁闷的原因拟另外发帖求助。
做实验过程中自己翻译的一点说明书，贴出来方便一下后面的战友！
QIANGEN Plasmid Midi and Maxi Kits 试剂盒说明书
QIANGEN Plasmid Midi and Maxi Kits 试剂盒
最大推荐培养容量
QIAGEN-tip100 QIAGEN-tip500
高拷贝质粒 25ml 100ml
低拷贝质粒 100ml 500ml
对QIAGEN-tip100，预期产量是75—100ug（高拷贝质粒）和20—100ug（低拷贝质粒）。
对QIAGEN-tip500，预期产量是300—500ug（高拷贝质粒）和100—500ug（低拷贝质粒）。
开始前需要做的事情：
•使用前向Buffer P1中加入提供的RNA酶A。
每瓶Buffer P1使用一小瓶RNA酶A（使用前向下旋转），终浓度为100ug/ml。
•由于低温保存，检查Buffer P2有无SDS沉淀。
如果必要，加热至37℃重溶SDS。
•预冷Buffer P3到4℃。
QIANGEN Plasmid Midi and Maxi Kits 试剂盒操作步骤
（红色代表使用QIANGEN Plasmid Midi Kit时的相应剂量；蓝色代表使用QIANGEN Plasmid Maxi Kit时的相应剂量。）
1、 从新鲜的划线选择平板中挑取一个单克隆菌落，接种到2-5ml含相应的选择抗生素的LB培养基上，37℃强烈振摇培育8h。
所用试管或烧瓶的容量至少是培养基容量的4倍。
2、 稀释起始培养物的1/1000到1/500，接种到选择性LB培养基。对于高拷贝质粒，接种25ml或100ml培养基；对于低拷贝质粒，接种100ml或500ml培养基。37℃强烈振摇培育12-16h。
烧瓶或试管的容量至少是培养基容量的4倍。培养物的细胞浓度大约为3－4×10^9个细胞/毫升，对应的沉淀物净重约为3克/升培养基。
3、 通过4℃6000×g离心15min收集细菌。
打开离心管，倒净上清液，直至所有培养基流净。
如果想暂时中止操作，应将沉淀冻存于－20℃。
4、 使用4ml或10ml Buffer P1重悬细菌沉淀。
为有效打散细菌，使用足够大的容纳溶解缓冲液混合物的试管是必要的。确保Buffer P1中加入了RNA酶A。细菌应通过上下吹打充分重悬，直至无细胞团块。
5、 加入4ml或10ml Buffer P2，轻轻颠倒混匀4－6次，室温5min。
不要吹打，因为这样会导致基因组DNA断裂。溶解产物应该显得粘稠。不要让溶解反应超过5min。使用后装Buffer P2的瓶子应立即盖上，以免被空气中的CO2酸化。
6、 加入4ml或10ml 预冷的Buffer P3，立即轻轻颠倒4－6次混匀，冰上培育15 min或20min。
使用冷冻的Buffer P3并冰上培育可增强沉淀作用。加入Buffer P3后，出现白色絮状沉淀，溶解产物变得不再粘稠。沉淀物包括基因组DNA、蛋白质、细胞碎片和SDS。溶解产物应充分混匀，以确保十二烷基硫酸钾沉淀。如果混合物仍然粘稠，呈褐色，则需充分混匀以完全中和溶液。
7、 在4℃≥20000×g离心30min，迅速转移含质粒DNA的上清液。
离心前，样本需再次混匀。离心应在非玻璃管中进行。20000×g对应12000rpm（BeckmanJA-17离心机）或13000rpm（SorvallSS-34离心机）。离心后上清液应该是清亮的。
8、 再次4℃≥20000×g离心15min，迅速转移含质粒DNA的上清液。
进行第2次离心的目的是为了避免出现混悬的颗粒样物质。混悬物（使样本显得混浊）可阻塞QIAGEN-tip，减慢或阻断重力流。
从清亮的溶解物上清液中取240ul或120ul样本，保存用于凝胶分析（样本1）以检测生长和溶解条件是否理想。
9、 加入4ml或10mlBuffer QBT以平衡QIAGEN-tip100或QIAGEN-tip500，静置让吸附柱流空。
缓冲液可由于平衡缓冲液中去污剂的作用进而降低表面张力而自动流出。让QIAGEN-tip完全流空。QIAGEN-tip会自动留下，因为缓冲液会在液面到达吸附柱上面的釉质时停止。
10、第8步的上清液加入QIAGEN-tip，使之因重力作用进入树脂。
上清液应迅速加至QIAGEN-tip。如果放置太久，会由于蛋白质进一步沉淀而变混浊，这是必须再次离心或过滤，以防止阻塞QIAGEN-tip。
从滤液中取240ul或120ul样本，保存用于凝胶分析（样本2）以检测QIAGEN树脂的DNA结合效率。
11、用2×10ml或2×30ml Buffer QC冲洗QIAGEN-tip。
让Buffer QC经重力作用流过QIAGEN-tip。第一遍冲洗足以去除大部分质粒DNA的污染物。第二遍冲洗在大量培养或菌株会产生大量碳水化合物时是非常必需的。
从冲洗液中取400ul或240ul样本，保存用于凝胶分析（样本3）。
12、用5ml或15ml Buffer QF洗脱DNA。
用10ml或30ml管收集洗脱液。不推荐使用聚碳酸酯离心管，因为聚碳酸酯不能耐受酒精。
从洗脱液中取100ul或60ul样本，保存用于凝胶分析（样本4）。
13、加入3.5ml或10.5ml（0.7volumes）室温异丙醇到洗脱下来的DNA中使DNA沉淀，立即混匀，并于4℃≥15000×g离心30min，小心倒出上清液。
所有溶液均在室温下进行以尽量减小盐析作用。尽管离心是在4℃进行以防样本过热。15000×g的离心力对应9500rpm（BeckmanJS-13离心机）或11000rpm（SorvallSS-34离心机）。作为选择，用后可丢弃的圆锥底离心管可用于4℃5000×g离心60min。异丙醇沉淀看起来像玻璃样，可能较絮状的含盐的乙醇沉淀难于观察。离心前在管外做好标记以使沉淀容易定位。异丙醇沉淀也松散地粘附于管壁，移去上清液时应小心。
14、用2ml或5ml 室温70%乙醇洗DNA沉淀，15000×g离心10min。小心倒出上清液，不要搅动沉淀。
作为选择，用后可丢弃的圆锥底离心管可用于4℃5000×g离心60min。70%乙醇去除沉淀的盐类，置换异丙醇，使DNA易于再溶解。
15、风干（自然干燥）沉淀5—10min，用适量缓冲液（实际上我们用的是1ml去离子水）再溶解DNA（例如：TE Buffer，PH8.0或10mM Tris-Cl，PH8.5）。
冲洗管壁回收全部DNA，重新溶解DNA沉淀，特别是使用玻璃管时。上下吹打DNA以促进重悬，可引起DNA剪断，应该避免。过分干燥会使DNA难于再溶。DNA溶解最好是在弱碱性环境下进行；在酸性缓冲液中不易溶解。
产量测定
检测产量，DNA浓度可通过UV分光光度法和琼脂糖凝胶定量分析检测。
琼脂糖凝胶分析
我们建议分装保存4个样本。如果质粒DNA的产量低或品质低，则可以琼脂糖凝胶电泳分析样本，以明确在抽提纯化过程的哪一步骤出现问题。
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QIANGEN Plasmid Midi and Maxi Kits 试剂盒说明书
QIANGEN Plasmid Midi and Maxi Kits 试剂盒
最大推荐培养容量
QIAGEN-tip100 QIAGEN-tip500
高拷贝质粒 25ml 100ml
低拷贝质粒 100ml 500ml
对QIAGEN-tip100，预期产量是75—100ug（高拷贝质粒）和20—100ug（低拷贝质粒）。
对QIAGEN-tip500，预期产量是300—500ug（高拷贝质粒）和100—500ug（低拷贝质粒）。
开始前需要做的事情：
•使用前向Buffer P1中加入提供的RNA酶A。
每瓶Buffer P1使用一小瓶RNA酶A（使用前向下旋转），终浓度为100ug/ml。
•由于低温保存，检查Buffer P2有无SDS沉淀。
如果必要，加热至37℃重溶SDS。
•预冷Buffer P3到4℃。
QIANGEN Plasmid Midi and Maxi Kits 试剂盒操作步骤
（红色代表使用QIANGEN Plasmid Midi Kit时的相应剂量；蓝色代表使用QIANGEN Plasmid Maxi Kit时的相应剂量。）
1、 从新鲜的划线选择平板中挑取一个单克隆菌落，接种到2-5ml含相应的选择抗生素的LB培养基上，37℃强烈振摇培育8h。
所用试管或烧瓶的容量至少是培养基容量的4倍。
2、 稀释起始培养物的1/1000到1/500，接种到选择性LB培养基。对于高拷贝质粒，接种25ml或100ml培养基；对于低拷贝质粒，接种100ml或500ml培养基。37℃强烈振摇培育12-16h。
烧瓶或试管的容量至少是培养基容量的4倍。培养物的细胞浓度大约为3－4×10^9个细胞/毫升，对应的沉淀物净重约为3克/升培养基。
3、 通过4℃6000×g离心15min收集细菌。
打开离心管，倒净上清液，直至所有培养基流净。
如果想暂时中止操作，应将沉淀冻存于－20℃。
4、 使用4ml或10ml Buffer P1重悬细菌沉淀。
为有效打散细菌，使用足够大的容纳溶解缓冲液混合物的试管是必要的。确保Buffer P1中加入了RNA酶A。细菌应通过上下吹打充分重悬，直至无细胞团块。
5、 加入4ml或10ml Buffer P2，轻轻颠倒混匀4－6次，室温5min。
不要吹打，因为这样会导致基因组DNA断裂。溶解产物应该显得粘稠。不要让溶解反应超过5min。使用后装Buffer P2的瓶子应立即盖上，以免被空气中的CO2酸化。
6、 加入4ml或10ml 预冷的Buffer P3，立即轻轻颠倒4－6次混匀，冰上培育15 min或20min。
使用冷冻的Buffer P3并冰上培育可增强沉淀作用。加入Buffer P3后，出现白色絮状沉淀，溶解产物变得不再粘稠。沉淀物包括基因组DNA、蛋白质、细胞碎片和SDS。溶解产物应充分混匀，以确保十二烷基硫酸钾沉淀。如果混合物仍然粘稠，呈褐色，则需充分混匀以完全中和溶液。
7、 在4℃≥20000×g离心30min，迅速转移含质粒DNA的上清液。
离心前，样本需再次混匀。离心应在非玻璃管中进行。20000×g对应12000rpm（BeckmanJA-17离心机）或13000rpm（SorvallSS-34离心机）。离心后上清液应该是清亮的。
8、 再次4℃≥20000×g离心15min，迅速转移含质粒DNA的上清液。
进行第2次离心的目的是为了避免出现混悬的颗粒样物质。混悬物（使样本显得混浊）可阻塞QIAGEN-tip，减慢或阻断重力流。
从清亮的溶解物上清液中取240ul或120ul样本，保存用于凝胶分析（样本1）以检测生长和溶解条件是否理想。
9、 加入4ml或10mlBuffer QBT以平衡QIAGEN-tip100或QIAGEN-tip500，静置让吸附柱流空。
缓冲液可由于平衡缓冲液中去污剂的作用进而降低表面张力而自动流出。让QIAGEN-tip完全流空。QIAGEN-tip会自动留下，因为缓冲液会在液面到达吸附柱上面的釉质时停止。
10、第8步的上清液加入QIAGEN-tip，使之因重力作用进入树脂。
上清液应迅速加至QIAGEN-tip。如果放置太久，会由于蛋白质进一步沉淀而变混浊，这是必须再次离心或过滤，以防止阻塞QIAGEN-tip。
从滤液中取240ul或120ul样本，保存用于凝胶分析（样本2）以检测QIAGEN树脂的DNA结合效率。
11、用2×10ml或2×30ml Buffer QC冲洗QIAGEN-tip。
让Buffer QC经重力作用流过QIAGEN-tip。第一遍冲洗足以去除大部分质粒DNA的污染物。第二遍冲洗在大量培养或菌株会产生大量碳水化合物时是非常必需的。
从冲洗液中取400ul或240ul样本，保存用于凝胶分析（样本3）。
12、用5ml或15ml Buffer QF洗脱DNA。
用10ml或30ml管收集洗脱液。不推荐使用聚碳酸酯离心管，因为聚碳酸酯不能耐受酒精。
从洗脱液中取100ul或60ul样本，保存用于凝胶分析（样本4）。
13、加入3.5ml或10.5ml（0.7volumes）室温异丙醇到洗脱下来的DNA中使DNA沉淀，立即混匀，并于4℃≥15000×g离心30min，小心倒出上清液。
所有溶液均在室温下进行以尽量减小盐析作用。尽管离心是在4℃进行以防样本过热。15000×g的离心力对应9500rpm（BeckmanJS-13离心机）或11000rpm（SorvallSS-34离心机）。作为选择，用后可丢弃的圆锥底离心管可用于4℃5000×g离心60min。异丙醇沉淀看起来像玻璃样，可能较絮状的含盐的乙醇沉淀难于观察。离心前在管外做好标记以使沉淀容易定位。异丙醇沉淀也松散地粘附于管壁，移去上清液时应小心。
14、用2ml或5ml 室温70%乙醇洗DNA沉淀，15000×g离心10min。小心倒出上清液，不要搅动沉淀。
作为选择，用后可丢弃的圆锥底离心管可用于4℃5000×g离心60min。70%乙醇去除沉淀的盐类，置换异丙醇，使DNA易于再溶解。
15、风干（自然干燥）沉淀5—10min，用适量缓冲液（实际上我们用的是1ml去离子水）再溶解DNA（例如：TE Buffer，PH8.0或10mM Tris-Cl，PH8.5）。
冲洗管壁回收全部DNA，重新溶解DNA沉淀，特别是使用玻璃管时。上下吹打DNA以促进重悬，可引起DNA剪断，应该避免。过分干燥会使DNA难于再溶。DNA溶解最好是在弱碱性环境下进行；在酸性缓冲液中不易溶解。
产量测定
检测产量，DNA浓度可通过UV分光光度法和琼脂糖凝胶定量分析检测。
琼脂糖凝胶分析
我们建议分装保存4个样本。如果质粒DNA的产量低或品质低，则可以琼脂糖凝胶电泳分析样本，以明确在抽提纯化过程的哪一步骤出现问题。
