【共享】待发表的综述：RNAi在药物最佳靶点筛选和鉴定中的应用
丁香园
2072
RNAi在药物最佳靶点筛选和鉴定中的应用
摘要
最佳药物靶点的筛选和鉴定是新药研发的核心，是药物开发的第一步，也是药物筛选及药物定向合成的关键因素之一。在过去十年里，科学界已经在此领域做出了巨大的提高，如：基因组学和蛋白质组学以及人类基因序列的测定，而且在制药工业的投资不断加大。然而新药研发受到多因素调节、单因素之间相互作用等复杂药物调节机制的制约，临床上药物疗效还涉及到药物代谢以及药物的毒副作用。因此急需能够加速和提高精确性的靶点筛选技术。最近才发展起来的RNA干扰（RNAi）技术已经成为一种强有力的筛选药物靶点和鉴定药物靶点的工具，这种方法能够有效高选择性地分解靶点的mRNA，基于此法引起的表型功能丢失可以确定相应蛋白质的功能。将此技术与高通量筛选、试管内生物分析以及活体疾病模型结合应用，提供了有效的检测基因功能的方法，这些技术的联合应用，将有效地提高药物靶点的筛选及鉴定。本文将介绍近年来RNAi技术在药物靶点筛选及鉴定的方法及取得的成就。
关键词 药物靶点，RNAi，高通量筛选。
简介
药物靶点的筛选和鉴定是耗资巨大的过程，证明疾病与大量基因中某个调节基因编码蛋白质的亚单位有关成为药学工业的巨大挑战。先前的科学工作提供了大量蛋白质在健康及疾病状态下可能的作用，这些都可能作为治疗疾病的靶点，另外人类基因组计划的完成提供了分析基因功能和药物开发前所未有的机会。然而由于基因敲除动物研究基因的调节机制实现周期长、代价昂贵，因此我们很难评估基因的功能而将以上这些信息成功地应用于新药靶点的筛选中。近年来迅速发展的RNAi技术能够特异地序列依赖性地沉默靶基因，使我们能够成功地在细胞、线虫等表达载体中鉴定基因的调节功能。
RNAi是一种有效的序列特异的转录后基因沉默技术，是Fire[13]等人在秀丽隐杆线虫中首先发现的。他们发现正义和反义RNA的复合物比单独的反义RNA更能有效地抑制基因的表达。这个过程是由同源于靶RNA的dsRNA介导的，引起靶RNA的转录抑制。RNA-Ⅲ核酸酶家族中的DICER切割长的dsRNA成近于21~23bp的短RNA，称之为小干扰RNA（siRNA），siRNA与蛋白质结合成RISC（RNA诱导的沉默复合物）介导了同源mRNA的分解。靶mRNA与siRNA反义链之间的碱基对决定了分解位点，这样siRNA高选择性地有效地分解了mRNA。更重要的是siRNA可以在试管内合成或由活体中质粒或病毒载体表达的短发卡RNA （shRNA）得到。这使得RNAi能够广泛应用于实验系统。
RNAi特异高效地抑制基因表达蛋白质，获得去基因功能表型，这产生了此相关蛋白重要的功能信息。重要的是这种技术仅需要少量的核酸序列信号，而且不被蛋白结构影响。而且siRNA的合成和控制较基因敲除或其他方法容易、资金消耗少，使得我们能够在短时间内大规模筛选靶点。
RNAi应用于药物最佳靶点筛选是本领域中活跃的发展方向之一，可以在人体组织细胞模型中直接沉默目的基因，从蛋白质分子水平研究药物的直接调节作用。
以下将介绍RNAi技术在药物开发不同阶段中有助于靶点筛选和鉴定的应用。
高通量筛选——靶点的初步筛选阶段
RNAi在高通量筛选中的应用，用来评估基因在生物相关系统中的作用。这种筛选可能包括成千上万的基因，甚至整个基因组。近来高通量筛选研究发现了许多以前未注意到的或不通过高通量筛选很难得到的一些我们感兴趣系统中基因的关键作用。
例如：感染性微生物威胁着人类健康，可以用高通量RNAi方法来分析。目的是为了寻找抑制微生物播散的方法，研究的焦点开始主要集中在对生长率的研究。
Forsyth[10]等通过在金黄色葡萄球菌中表达反义RNA鉴别出了致病性葡萄球菌生长的关键基因。在这些鉴别出来的与金黄色葡萄球菌生长相关的基因中，168个与生殖器支原体直接同源，近86%的这些基因曾证明与生殖器支原体的生长有关。因此，证明了这种利用RNAi来鉴别生长调节基因的有效性。De Backer[11]等人也用同样的方法鉴别了真菌病原体白色念珠菌的生长关键基因。
在Forsyth[10]和De backer[11]等人的研究中，敲除生长关键基因与传统药物筛选途径联合应用，可以用来筛选药物。当RNAi使靶蛋白表达水平急剧下降时，药物能够高效地与低水平的靶蛋白相互作用，这样我们就可以从大量的化学分子中筛选出高效的药物，这种联合的方法能够加速干扰病原体生长药物的筛选。另外，此方法的另一个好处就是可以利用从实验微生物得到的生长基因信息分析比较与他相关种属的微生物，得到它们之间调节生长的共同通路和唯一通路。由此我们可以发现作用于共同通路的广谱型抗病原微生物药物，和作用于唯一通路的菌种特异型抗病原微生物的药物。
肿瘤的发生是体细胞突变而造成的大量增殖过程，高通量RNAi技术可以用来筛选与恶性增殖相关的基因和蛋白质以及确定调节增殖的信号通路，这些为肿瘤新药筛选及治疗提供了大量有用的信息。为了研究基因的功能，可以用上调基因表达的方法，但这种方法很难看到明显的现象，而沉默基因的表达却很容易观察到现象。基因敲除小鼠和显性负相技术都可行，但是十分昂贵不能用于大规模鉴定基因功能，RNAi技术可以直接在试管培养的细胞中应用，而且并不昂贵，因此可以在基因组内大规模高通量地鉴定基因的功能。这样在整个基因组范围内应用RNAi得到表型信息与肿瘤中异常增殖的细胞相联系就可以鉴别出能够作为抗肿瘤药物靶点和治疗肿瘤的关键基因和蛋白。
Lum[12]等人用RNAi技术研究Hedgehog（Hh）信号通路的组分，这条通路在胚胎期促进正常细胞增殖，但是如果在后期激活将导致肿瘤的发生。Lum等人将Hh敏感的荧光受体和已知与Hh通路有关系得调节因子的dsRNA共转染到成虫CL8细胞中，在敲除Hh通路调节组分的细胞中观察到了预期的变化，这提供了功能分析有力的证据。研究者之后合成及筛选了5700种靶向基因的dsRNA，其中43%是已知的果蝇基因，发现了4个新的调节Hh信号通路的基因。它们将siRNA注入到果蝇胚胎的前胚盘中，进一步研究了其中的两个基因：酪蛋白激酶（ck-α）和Dally-like蛋白（dlp），结果引起了信号通路蛋白的不表达，无翅表型的出现，这说明了这两个基因是在Hh信号通路下发挥作用的。接下来的研究可能将这些筛选中的信息应用于新的抗肿瘤药物的开发。
RNAi阵列文库同样可以用于筛选使细胞对生长因子抑制物、细胞凋亡因子或其他化疗药物敏感的基因。也可以在药物选择性毒害的细胞中应用RNAi技术增加或降低化学毒性，来筛选出对药物敏感的基因。
以上这些研究证明了RNAi高通量筛选能够快速鉴别新药靶点的能力。然而应注意，从高通量筛选的靶并不是绝对确定性的，还应该更加彻底认真地研究基因的功能。
试管内、体外表达模型的生物分析——进一步鉴定最佳药物靶点
某些基因的表现型信息十分有限（如从表达方面或者生物信息学预测得到的信息），因此在这种情况下，在将此基因确定为药物靶点之前时需要进一步的实验来评估基因功能。这些实验通常是在试管内进行的，用来确定靶蛋白在特殊生物系统中或者在疾病状态下的作用。另外，排除候选基因也是非常必要的，因为这可以减少多余的分析和额外的开销。
RNAi提供了一个直接确定药物靶点蛋白质功能的方法。以下实验证明了这种方法在阐明疾病中某组分的功能以及发现疾病信号通路包含的组分的有效应用。
在慢性髓细胞性白血病（CML）中，95%都有Philadephia易位，导致c-abl激酶与破碎点簇区（BCR）融合。嵌合蛋白BCR/abl表达持续的abl酪氨酸激酶活性，导致细胞增殖上调和对凋亡信号反应性减弱。用RNAi沉默BCR-abl的表达能够抑制CML，说明BCR-abl在CML中具有特异的病理调节机制，这为肿瘤药物提供了一个理想的颇具潜力的药物靶点。
早已证实血管内皮细胞生长因子（VEGF）能够刺激血管生成以及维持肿瘤细胞的生存。Chung等人阐明了人乳头瘤细胞系中整联蛋白α6β4调节VEGF翻译过程中的作用。在原来不表达内源性α6β4 的MDA-MB-435细胞中过表达α6β4，使其在去血清的情况下不发生凋亡。在另一表达内源α6β4的细胞系中，使用siRNA靶向整联蛋白β4亚基引起β4和VEGF的表达下降，细胞凋亡上升。这些结果证明存在其他翻译起始信号通路调节机制，同时揭示了α6β4是VEGF翻译的重要调节因子，因此也为抗肿瘤药物的研发提供了一个具有重大潜力的治疗靶点。[1]
在体内模型中最佳药物靶点的鉴定——验证最佳靶点的治疗疗效。
从高通量筛选中可以得到和某种疾病相关的基因库，在哺乳动物培养细胞中药物靶点的鉴定可以给出疾病状态下的候选基因的调节功能。然而最终是否能用于临床治疗是要看在动物模型内阻断候选基因是否能减缓病症。一个有效的方法就是利用RNAi阻断模拟人疾病状态的动物模型中的基因的表达，这一步成功与否决定了是否能用于临床治疗，也是新药开发最后且关键的一步。
鉴于近来向活体中转染siRNA技术的不断提高，已经成功鼠疾病模型的疾病相关基因，这些研究已经证明RNAi在活体动物模型中坚定最佳药物靶点的可能性。对K-ras的研究[14]就是RNAi用于在活体内鉴定抗癌药物靶点很好的例子：多数恶性肿瘤是突变基因与野生型等位基因共同表达，在这种情况下应用RANi技术将显示出极大的优越性。K-rasV12是在多数人类肿瘤中突变的K- ras基因，研究人员将靶向K-rasV12mRNA的shRNA置于Pol Ⅲ启动子下游，并整合到逆转录病毒载体中，将这种病毒感染人胰腺癌细胞，Western blot分析细胞裂解物表明siRNA选择性地沉默突变型K-ras而不抑制野生型K-ras。将空载体及K-rasV12的siRNA分别转导入培养的癌细胞中，再分别注射到裸鼠体内，和预期的结果相吻合：注入空载体细胞系的裸鼠高表达K-rasV12mRNA，并且在5天内发生肿瘤；而注射含有siRNA细胞系的裸鼠体内不表达K-rasV12的mRNA，故未发生肿瘤，这些结果证明了K-rasV12是胰腺癌中一个很好的抗肿瘤药物靶点。
另一个RNAi在活体内鉴定药物靶点的例子是：siRNA沉默Fas配体的表达可以抑制自身免疫病性肝炎中Fas介导的肝细胞凋亡[15]。在高压水流转染后，荧光siRNA分析表明大于88%的肝细胞成功转染了siRNA，在转染10天后Fas特异的siRNA抑制85%靶蛋白的表达，而且在20天内mRNA水平不能恢复到正常水平。采集siRNA处理过的鼠的肝细胞，在试管内分析Fas配体介导的细胞凋亡，显示出siRNA处理是从如下两方面起到强烈的保护作用的：（1）抑制抗体介导的细胞凋亡，（2）抑制激活的肝单核细胞的细胞毒作用。Fas特异的siRNA在鼠急性肝炎模型中表达，可以抑制肝脏的坏死、发炎及死亡，这个结果证明Fas配体是治疗自身免疫病性肝炎的一个很好的药物靶点。
以上这些都已证明RNAi能够在活体内阻断靶基因的表达，说明RNAi可以验证药物筛选中候选靶点在活体内的功能，为鉴定候选靶点最终是否能作为新药靶点提供了有力的证据。
然而裸露的siRNA在血清中易被强有力的内切核酸酶降解。如何成功地将siRNA转运到活体内表达，是RNAi在活体中应用的关键一步。为此人们运用质粒和病毒载体的方法来转运siRNA或shRNA。 这些表达载体携带siRNA使其在细胞中持续表达，持久地抑制靶mRNA编辑的蛋白质的表达。另外病毒载体能够大大提高转染效率，尤其是有丝分裂期后的细胞转染，而且能够在活体中获得持续的表达。如：Van等人成功运用慢病毒载体转运shRNA导致鼠脑中基因表达沉默[8]，Hommel等人利用腺相关病毒成功地将siRNA转运到鼠脑中[9]。
讨论及展望
RNAi现象自从Fire[13]等在线虫中发现以来在短短几年内迅速发展，它凭借着能够特异沉默靶基因的表达，而证明基因和其编码蛋白质的功能，已经被广泛应用于生物学、医学、药学等广泛领域。尤其是在新药研发领域已经显示出了巨大的作用和潜力，为我们提供了大量的能够应用于临床的最佳药物靶点和治疗靶点，同时在新药研发有效成分方面也得到了广泛的应用。我们可以将RNAi技术和其他技术的联合应用，可以分析出与疾病相关的通路，找到这些通路与正常细胞通路的共同通路和异同通路。针对异同通路，应用高通量化学分子的筛选，便可得到一个此通路特异性的化学分子库。如此多的化学分子中必然有大量低亲和力、不适于作为药物的分子，我们可以再次使用RNAi技术降低靶蛋白的数量（但不是完全消除），再次将筛选出的分子作用于细胞，便可排除那些在靶蛋白低浓度时无效的化学分子，得到高效的针对靶点的药物。这些药物经过动物模型筛选，临床实验等过程，最终便可以获得新的高效的药物。对于致病性微生物，我们不仅可以选择异同通路作为种属特异性药物的靶点，还可以选择相同通路，来筛选广谱型抗病原微生物的药物。
但是RNAi的原理尚不完全清楚，还有许多问题和不足，如：沉默某靶蛋白，可能会引起包含此靶蛋白的复合物的功能的丧失，因此沉默导致的效应并不是靶蛋白的直接效应。siRNA沉默的是mRNA的转录过程，并不直接作用于蛋白质，由于蛋白质存在着半衰期，可能会影响到我们对靶蛋白功能的研究。
虽然RNAi仍有许多不足，但随着对RNAi机制的不断了解，以及RNAi应用取得的巨大成就，我相信RNAi技术在不久的将来会得到普遍的应用以及会取得更多更大的成就。
参考文献：
1. Karen S Lavery &Thomas H Kinundefined:Antisense and RNAi: Powerful tools in drug target discovery and validation. Current Opinion in Drug Discovery & Development 2003 6(4):561-569 @ Current Drugs ISSN 1367-6733.
2. Quinn L. Deveraux∗, Pedro Aza-Blanc, Klaus W. Wagner, Dirk Bauerschlag,Michael P. Cooke, Garret M. Hampton∗: Exposing oncogenic dependencies for cancer drug target discovery and validation using RNAi. The Genomics Institute of Novartis Research Institute Foundation, 10675 John Jay Hopkins Drive, San Diego, CA 92121, USAAccepted 28 April 2003.
3. Julie L.C. Kan1~undefined, Graeme Griffin1, Gregory J. Hannon2: Mining the genome with RNAi to select cancer drug targets.Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies.vol.1.No.4.2004
4. David J. Shuey, Daniel E. McCallus and Tony Giordano: RNAi: gene-silencing in therapeutic Intervention. DDT Vol. 7, No. 20 October 2002.
5. Simon W Jones1, Patricia M de Souza2 and Mark A Lindsay2_: siRNA for gene silencing: a route to drug target discovery. Current Opinion in Pharmacology 2004, 4:522–527.
6. OLLIVIER MILHAVET, DEVIN S. GARY, AND MARK P. MATTSON: RNA Interference in Biology and Medicine. PHARMACOLOGICAL REVIEWS Vol. 55, No. 4.
7. Carolyn A. Behm1, Mary M. Bendig2, James P.McCarter3 and Ann E. Sluder: RNAi-based discovery and validation of new drug targets in filarial nematodes. TRENDS in Parasitology Vol.21 No.3 March 2005
8. Van den HC, Eggermont K, Nuttin B, Debyser Z, Baekelandt V: Lentiviral vector-mediated delivery of short hairpin RNA results in persistent knockdown of gene expression in mouse brain. Hum Gene Ther 2003, 14:1799-1807.
9. Hommel JD, Sears RM, Georgescu D, Simmons DL, DiLeone RJ: Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nat Med 2003, 9:539-544.
10. Forsyth RA, Haselbeck RJ, Ohlsen KL, Yamamoto RT, Xu H, Trawick JD, Wall D, Wang L, Brown-Driver V, Froelich JM, C KG et al: A genome-wide strategy for the identification of essential genes in Staphylococcus aureus. Mol Microbiol (2002) 43(6):1387-1400.
11. De Backer MD, Nelissen B, Logghe M, Viaene J, Loonen I, Vandoninck S, de Hoogt R, Dewaele S, Simons FA, Verhasselt P, Vanhoof G et al: An antisense-based functional genomics approach for identification of genes critical for growth of Candida albicans. Nat Biotechnol (2001) 19 (3): 235-241
12. Lum L, Yao S, Mozer B, Rovescalli A, Von Kessler D, Nirenberg M, Beachy PA: Identification of Hedgehog pathway components by RNAi in Drosophila cultured cells. Science (2003) 299(5615):2039-2045.
13. Fire A,Xu S,Montgomery MK,etal. Potent and specific genetic interference by double- stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature,1 998,3 91∶ 80 6- 81 1
14. Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R: Stable suppression oftumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer Cell (2002) 2(3):243-247.
15. Song E, Lee SK, Wang J, Ince N, Ouyang N, Min J, Chen J, Shankar P, Lieberman J: RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat Med (2003) 9(3):347-351.
摘要
最佳药物靶点的筛选和鉴定是新药研发的核心，是药物开发的第一步，也是药物筛选及药物定向合成的关键因素之一。在过去十年里，科学界已经在此领域做出了巨大的提高，如：基因组学和蛋白质组学以及人类基因序列的测定，而且在制药工业的投资不断加大。然而新药研发受到多因素调节、单因素之间相互作用等复杂药物调节机制的制约，临床上药物疗效还涉及到药物代谢以及药物的毒副作用。因此急需能够加速和提高精确性的靶点筛选技术。最近才发展起来的RNA干扰（RNAi）技术已经成为一种强有力的筛选药物靶点和鉴定药物靶点的工具，这种方法能够有效高选择性地分解靶点的mRNA，基于此法引起的表型功能丢失可以确定相应蛋白质的功能。将此技术与高通量筛选、试管内生物分析以及活体疾病模型结合应用，提供了有效的检测基因功能的方法，这些技术的联合应用，将有效地提高药物靶点的筛选及鉴定。本文将介绍近年来RNAi技术在药物靶点筛选及鉴定的方法及取得的成就。
关键词 药物靶点，RNAi，高通量筛选。
简介
药物靶点的筛选和鉴定是耗资巨大的过程，证明疾病与大量基因中某个调节基因编码蛋白质的亚单位有关成为药学工业的巨大挑战。先前的科学工作提供了大量蛋白质在健康及疾病状态下可能的作用，这些都可能作为治疗疾病的靶点，另外人类基因组计划的完成提供了分析基因功能和药物开发前所未有的机会。然而由于基因敲除动物研究基因的调节机制实现周期长、代价昂贵，因此我们很难评估基因的功能而将以上这些信息成功地应用于新药靶点的筛选中。近年来迅速发展的RNAi技术能够特异地序列依赖性地沉默靶基因，使我们能够成功地在细胞、线虫等表达载体中鉴定基因的调节功能。
RNAi是一种有效的序列特异的转录后基因沉默技术，是Fire[13]等人在秀丽隐杆线虫中首先发现的。他们发现正义和反义RNA的复合物比单独的反义RNA更能有效地抑制基因的表达。这个过程是由同源于靶RNA的dsRNA介导的，引起靶RNA的转录抑制。RNA-Ⅲ核酸酶家族中的DICER切割长的dsRNA成近于21~23bp的短RNA，称之为小干扰RNA（siRNA），siRNA与蛋白质结合成RISC（RNA诱导的沉默复合物）介导了同源mRNA的分解。靶mRNA与siRNA反义链之间的碱基对决定了分解位点，这样siRNA高选择性地有效地分解了mRNA。更重要的是siRNA可以在试管内合成或由活体中质粒或病毒载体表达的短发卡RNA （shRNA）得到。这使得RNAi能够广泛应用于实验系统。
RNAi特异高效地抑制基因表达蛋白质，获得去基因功能表型，这产生了此相关蛋白重要的功能信息。重要的是这种技术仅需要少量的核酸序列信号，而且不被蛋白结构影响。而且siRNA的合成和控制较基因敲除或其他方法容易、资金消耗少，使得我们能够在短时间内大规模筛选靶点。
RNAi应用于药物最佳靶点筛选是本领域中活跃的发展方向之一，可以在人体组织细胞模型中直接沉默目的基因，从蛋白质分子水平研究药物的直接调节作用。
以下将介绍RNAi技术在药物开发不同阶段中有助于靶点筛选和鉴定的应用。
高通量筛选——靶点的初步筛选阶段
RNAi在高通量筛选中的应用，用来评估基因在生物相关系统中的作用。这种筛选可能包括成千上万的基因，甚至整个基因组。近来高通量筛选研究发现了许多以前未注意到的或不通过高通量筛选很难得到的一些我们感兴趣系统中基因的关键作用。
例如：感染性微生物威胁着人类健康，可以用高通量RNAi方法来分析。目的是为了寻找抑制微生物播散的方法，研究的焦点开始主要集中在对生长率的研究。
Forsyth[10]等通过在金黄色葡萄球菌中表达反义RNA鉴别出了致病性葡萄球菌生长的关键基因。在这些鉴别出来的与金黄色葡萄球菌生长相关的基因中，168个与生殖器支原体直接同源，近86%的这些基因曾证明与生殖器支原体的生长有关。因此，证明了这种利用RNAi来鉴别生长调节基因的有效性。De Backer[11]等人也用同样的方法鉴别了真菌病原体白色念珠菌的生长关键基因。
在Forsyth[10]和De backer[11]等人的研究中，敲除生长关键基因与传统药物筛选途径联合应用，可以用来筛选药物。当RNAi使靶蛋白表达水平急剧下降时，药物能够高效地与低水平的靶蛋白相互作用，这样我们就可以从大量的化学分子中筛选出高效的药物，这种联合的方法能够加速干扰病原体生长药物的筛选。另外，此方法的另一个好处就是可以利用从实验微生物得到的生长基因信息分析比较与他相关种属的微生物，得到它们之间调节生长的共同通路和唯一通路。由此我们可以发现作用于共同通路的广谱型抗病原微生物药物，和作用于唯一通路的菌种特异型抗病原微生物的药物。
肿瘤的发生是体细胞突变而造成的大量增殖过程，高通量RNAi技术可以用来筛选与恶性增殖相关的基因和蛋白质以及确定调节增殖的信号通路，这些为肿瘤新药筛选及治疗提供了大量有用的信息。为了研究基因的功能，可以用上调基因表达的方法，但这种方法很难看到明显的现象，而沉默基因的表达却很容易观察到现象。基因敲除小鼠和显性负相技术都可行，但是十分昂贵不能用于大规模鉴定基因功能，RNAi技术可以直接在试管培养的细胞中应用，而且并不昂贵，因此可以在基因组内大规模高通量地鉴定基因的功能。这样在整个基因组范围内应用RNAi得到表型信息与肿瘤中异常增殖的细胞相联系就可以鉴别出能够作为抗肿瘤药物靶点和治疗肿瘤的关键基因和蛋白。
Lum[12]等人用RNAi技术研究Hedgehog（Hh）信号通路的组分，这条通路在胚胎期促进正常细胞增殖，但是如果在后期激活将导致肿瘤的发生。Lum等人将Hh敏感的荧光受体和已知与Hh通路有关系得调节因子的dsRNA共转染到成虫CL8细胞中，在敲除Hh通路调节组分的细胞中观察到了预期的变化，这提供了功能分析有力的证据。研究者之后合成及筛选了5700种靶向基因的dsRNA，其中43%是已知的果蝇基因，发现了4个新的调节Hh信号通路的基因。它们将siRNA注入到果蝇胚胎的前胚盘中，进一步研究了其中的两个基因：酪蛋白激酶（ck-α）和Dally-like蛋白（dlp），结果引起了信号通路蛋白的不表达，无翅表型的出现，这说明了这两个基因是在Hh信号通路下发挥作用的。接下来的研究可能将这些筛选中的信息应用于新的抗肿瘤药物的开发。
RNAi阵列文库同样可以用于筛选使细胞对生长因子抑制物、细胞凋亡因子或其他化疗药物敏感的基因。也可以在药物选择性毒害的细胞中应用RNAi技术增加或降低化学毒性，来筛选出对药物敏感的基因。
以上这些研究证明了RNAi高通量筛选能够快速鉴别新药靶点的能力。然而应注意，从高通量筛选的靶并不是绝对确定性的，还应该更加彻底认真地研究基因的功能。
试管内、体外表达模型的生物分析——进一步鉴定最佳药物靶点
某些基因的表现型信息十分有限（如从表达方面或者生物信息学预测得到的信息），因此在这种情况下，在将此基因确定为药物靶点之前时需要进一步的实验来评估基因功能。这些实验通常是在试管内进行的，用来确定靶蛋白在特殊生物系统中或者在疾病状态下的作用。另外，排除候选基因也是非常必要的，因为这可以减少多余的分析和额外的开销。
RNAi提供了一个直接确定药物靶点蛋白质功能的方法。以下实验证明了这种方法在阐明疾病中某组分的功能以及发现疾病信号通路包含的组分的有效应用。
在慢性髓细胞性白血病（CML）中，95%都有Philadephia易位，导致c-abl激酶与破碎点簇区（BCR）融合。嵌合蛋白BCR/abl表达持续的abl酪氨酸激酶活性，导致细胞增殖上调和对凋亡信号反应性减弱。用RNAi沉默BCR-abl的表达能够抑制CML，说明BCR-abl在CML中具有特异的病理调节机制，这为肿瘤药物提供了一个理想的颇具潜力的药物靶点。
早已证实血管内皮细胞生长因子（VEGF）能够刺激血管生成以及维持肿瘤细胞的生存。Chung等人阐明了人乳头瘤细胞系中整联蛋白α6β4调节VEGF翻译过程中的作用。在原来不表达内源性α6β4 的MDA-MB-435细胞中过表达α6β4，使其在去血清的情况下不发生凋亡。在另一表达内源α6β4的细胞系中，使用siRNA靶向整联蛋白β4亚基引起β4和VEGF的表达下降，细胞凋亡上升。这些结果证明存在其他翻译起始信号通路调节机制，同时揭示了α6β4是VEGF翻译的重要调节因子，因此也为抗肿瘤药物的研发提供了一个具有重大潜力的治疗靶点。[1]
在体内模型中最佳药物靶点的鉴定——验证最佳靶点的治疗疗效。
从高通量筛选中可以得到和某种疾病相关的基因库，在哺乳动物培养细胞中药物靶点的鉴定可以给出疾病状态下的候选基因的调节功能。然而最终是否能用于临床治疗是要看在动物模型内阻断候选基因是否能减缓病症。一个有效的方法就是利用RNAi阻断模拟人疾病状态的动物模型中的基因的表达，这一步成功与否决定了是否能用于临床治疗，也是新药开发最后且关键的一步。
鉴于近来向活体中转染siRNA技术的不断提高，已经成功鼠疾病模型的疾病相关基因，这些研究已经证明RNAi在活体动物模型中坚定最佳药物靶点的可能性。对K-ras的研究[14]就是RNAi用于在活体内鉴定抗癌药物靶点很好的例子：多数恶性肿瘤是突变基因与野生型等位基因共同表达，在这种情况下应用RANi技术将显示出极大的优越性。K-rasV12是在多数人类肿瘤中突变的K- ras基因，研究人员将靶向K-rasV12mRNA的shRNA置于Pol Ⅲ启动子下游，并整合到逆转录病毒载体中，将这种病毒感染人胰腺癌细胞，Western blot分析细胞裂解物表明siRNA选择性地沉默突变型K-ras而不抑制野生型K-ras。将空载体及K-rasV12的siRNA分别转导入培养的癌细胞中，再分别注射到裸鼠体内，和预期的结果相吻合：注入空载体细胞系的裸鼠高表达K-rasV12mRNA，并且在5天内发生肿瘤；而注射含有siRNA细胞系的裸鼠体内不表达K-rasV12的mRNA，故未发生肿瘤，这些结果证明了K-rasV12是胰腺癌中一个很好的抗肿瘤药物靶点。
另一个RNAi在活体内鉴定药物靶点的例子是：siRNA沉默Fas配体的表达可以抑制自身免疫病性肝炎中Fas介导的肝细胞凋亡[15]。在高压水流转染后，荧光siRNA分析表明大于88%的肝细胞成功转染了siRNA，在转染10天后Fas特异的siRNA抑制85%靶蛋白的表达，而且在20天内mRNA水平不能恢复到正常水平。采集siRNA处理过的鼠的肝细胞，在试管内分析Fas配体介导的细胞凋亡，显示出siRNA处理是从如下两方面起到强烈的保护作用的：（1）抑制抗体介导的细胞凋亡，（2）抑制激活的肝单核细胞的细胞毒作用。Fas特异的siRNA在鼠急性肝炎模型中表达，可以抑制肝脏的坏死、发炎及死亡，这个结果证明Fas配体是治疗自身免疫病性肝炎的一个很好的药物靶点。
以上这些都已证明RNAi能够在活体内阻断靶基因的表达，说明RNAi可以验证药物筛选中候选靶点在活体内的功能，为鉴定候选靶点最终是否能作为新药靶点提供了有力的证据。
然而裸露的siRNA在血清中易被强有力的内切核酸酶降解。如何成功地将siRNA转运到活体内表达，是RNAi在活体中应用的关键一步。为此人们运用质粒和病毒载体的方法来转运siRNA或shRNA。 这些表达载体携带siRNA使其在细胞中持续表达，持久地抑制靶mRNA编辑的蛋白质的表达。另外病毒载体能够大大提高转染效率，尤其是有丝分裂期后的细胞转染，而且能够在活体中获得持续的表达。如：Van等人成功运用慢病毒载体转运shRNA导致鼠脑中基因表达沉默[8]，Hommel等人利用腺相关病毒成功地将siRNA转运到鼠脑中[9]。
讨论及展望
RNAi现象自从Fire[13]等在线虫中发现以来在短短几年内迅速发展，它凭借着能够特异沉默靶基因的表达，而证明基因和其编码蛋白质的功能，已经被广泛应用于生物学、医学、药学等广泛领域。尤其是在新药研发领域已经显示出了巨大的作用和潜力，为我们提供了大量的能够应用于临床的最佳药物靶点和治疗靶点，同时在新药研发有效成分方面也得到了广泛的应用。我们可以将RNAi技术和其他技术的联合应用，可以分析出与疾病相关的通路，找到这些通路与正常细胞通路的共同通路和异同通路。针对异同通路，应用高通量化学分子的筛选，便可得到一个此通路特异性的化学分子库。如此多的化学分子中必然有大量低亲和力、不适于作为药物的分子，我们可以再次使用RNAi技术降低靶蛋白的数量（但不是完全消除），再次将筛选出的分子作用于细胞，便可排除那些在靶蛋白低浓度时无效的化学分子，得到高效的针对靶点的药物。这些药物经过动物模型筛选，临床实验等过程，最终便可以获得新的高效的药物。对于致病性微生物，我们不仅可以选择异同通路作为种属特异性药物的靶点，还可以选择相同通路，来筛选广谱型抗病原微生物的药物。
但是RNAi的原理尚不完全清楚，还有许多问题和不足，如：沉默某靶蛋白，可能会引起包含此靶蛋白的复合物的功能的丧失，因此沉默导致的效应并不是靶蛋白的直接效应。siRNA沉默的是mRNA的转录过程，并不直接作用于蛋白质，由于蛋白质存在着半衰期，可能会影响到我们对靶蛋白功能的研究。
虽然RNAi仍有许多不足，但随着对RNAi机制的不断了解，以及RNAi应用取得的巨大成就，我相信RNAi技术在不久的将来会得到普遍的应用以及会取得更多更大的成就。
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