【共享】超纯质粒制备操作细则

1溶液配制:
1.1 Buffer P1:(悬浮用)
  成分：50mM Tris.HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 100ug/mL Rnase A
  配制：
  2M Tris.HCl, pH 8.0  25mL
  0.5M EDTA, pH 8.0  20mL
双蒸水至 1L，灭菌。
使用前每1L buffer加入100mg RNAse A，并于4℃保存。
1.2 Buffer P2：（裂解用）
  成分：200mM NaOH, 1% SDS
  配制：
  8g NaOH固体溶解于500mL双蒸水中，成0.4M NaOH溶液
  10g SDS溶于500mL双蒸水中，成2% SDS溶液
  使用前将上述两种溶液等体积混合后使用
  注意：
    Buffer P2混合后不宜放置时间过场，每次配够一周使用的即可。长时间放置容易产生沉淀。若有沉淀产生，在37℃保温一段时间使沉淀溶解。
1.3 Buffer P3：（中和用）
  成分：3M KAc（醋酸钾），pH4.8
  配制：将147g KAc 溶于350mL双蒸水中，用约60mL冰醋酸调节PH值，然后继续用浓盐酸调节pH值至约5左右.最后定容至500mL。
1.4 Buffer QBT:(平衡用)
成分：750mL NaCl; 50mM MOPS.Ph7.0;15% 异丙醇，0.15% Triton X-100
配制：溶解43.83g NaCl, 10.46g MOPS到800 mL　双蒸水中，调节pH值至7.0，然后加入150mL 异丙醇和15Ml Triton X-100,加水定容至1L。
1.5 Buffer QC：（洗涤用）
成分：1.0 M NaCl，50Mm MOPS, Ph7.0
配制：溶解58.44g NaCl, 10.46 MOPS至800 mL 双蒸水中，调节pH值至7.0,然后加入150mL异丙醇，定容至1L。
2 Qiagen-tip 20质粒小量提取操作步骤
2.1 取过夜培养的菌液2mL，12000rpm离心30秒至1分钟，去净上清。
2.2用0.3mL Buffer P1重新充分悬浮沉淀。
2.3加入0.3mL Buffer P2，轻轻颠倒摇匀，室温下放置5分钟。
注意：此步不应剧烈振荡，否则容易在所提质粒中混入基因组DNA。
2.4 Buffer P2使用后应盖紧盖子，否则NaOH易与空气中的CO2起反应。
2.5 加入0.3mL Buffer P3，轻轻混匀，于4℃冰箱中放置10分钟。
12000rpm高速离心15分钟。
2.6 用1mL Buffer QBT平衡Qiagen-tip 20柱，并让QBT慢慢流下。
2.7 将步骤5所得的上清倒入已平衡好的Qiagen-tip 20柱，让其慢慢流下。
2.8 每次用1mL QC清洗Qiagen-tip 20柱，清洗3次。
2.9用0.8mL QF洗脱DNA。
2.10 用0.6倍体积（500uL）的异丙醇沉淀质粒，颠倒混匀，室温放置5分钟,12000rpm高速离心15分钟。
2.11去上清，用1mL 70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm高速离心3分钟，去净上清。
2.12重复步骤11一次。
注意：洗涤时，每次用吸水纸吸一下，尽量去净残余的液体。
去净上清很重要，否则除不净多余的盐分，将严重影响的后面的测序反应。
2.13 抽干多余的乙醇，用30～50uL双蒸水溶解DNA,取2uL电泳检测定量，用于测序。
3 Qiagen-tip 20柱子的清洗处理
3.1用5mL缓冲液清洗柱子，洗去多余的DNA及其他杂质，备用。