【资源】核酸杂交(Southern blot和Nouthern blot)疑惑解析-------送给新手们的礼物

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核酸杂交（Nucleicacid hybridization），又称核酸分子杂交。
原理：是核酸变性和复性理论。双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开形成单链，当理化因素消除后，具一定同源性的两条（探针和待测核苷酸序列）单链在适宜的温度及离子强度条件下，可按碱基互补配对原则特异性地复性形成双链。核酸分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。
分类：核酸分子杂交按作用环境不同分为固相核酸分子杂交和液相核酸分子杂交。
一、固相核酸分子杂交
原理：将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。固相杂交时，未杂交的游离片段很容易漂洗除去，膜上的杂交物容易检测并能防止靶DNA自我复性，故该方法最为常用。
常用类型：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Sou thern blot杂交、Northern blot杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。
基本操作步骤：
1、制备样品：从待检测组织样品中提取DNA或RNA。DNA应先用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。再将含有Dundefined*段的凝胶进行变性处理后，直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。
2、制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。这样，通过检测与转印膜上的核酸分子结合的探针分子，就可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的分子大小。
3、杂交：在杂交前先进行预杂交，封闭膜上非特异的DNA结合位点，以降低非特异性杂交。正式杂交时，由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以核酸杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。
4、检测：检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要放射自显影来检测核酸片段在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。
二、液相核酸分子杂交
液相核酸分子杂交，是一种研究最早且操作复杂的核酸杂交类型，在过去的30年里虽被应用，但总不如固相杂交那样普遍，主要原因是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难，误差也较高。

常用的两种固相核酸分子杂交技术
1 .Southern Blot

原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
2. Northern Blot
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

常见问题
Q1：标记方法有哪几种？
A1：（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法
Q2：探针标记物的分类有几种？
A2：（1）探针标记物有放射性核素与非放射性物质两种。放射性核素标记敏感性高，可检测pg水平的核酸，但因不易长期保存，且存在放射性污染等问题，现已较少应用。
（2）非放射性物质常用的有生物素、地高辛等，非放射性探针安全、稳定、操作方便并且经济，但敏感性较低，近年来，由于杂交信号检测方法的改进，检测的敏感性得到了很大提高。
Q3：怎样确定探针的浓度？
A3：总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。要获得较满意的敏感性，膜核酸分子杂交中放射性核素标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5-10 ng/ml和25-1000 ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5-5.0 μg/ml。
Q4：如何选择核酸分子杂交的最适温度？
A4：核酸分子杂交技术最重要的因素之一是选择最适的核酸分子杂交反应温度。若反应温度低于Tm 10-15 ℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30 ℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。最适复性温度：Tor =Tm–25 ℃苛刻复性温度：Ts = Tm – (10或15 ℃)非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30或35 ℃)
Q5：核酸杂交筛选寡核苷酸探针遵循哪些原则？
A5：（1）长18-50 nt，较长探针杂交时间较长，合成量低；较短探针特异性会差些。
　 （2）碱基成分：G+C含量为40%-60%，超出此范围则会增加非特异核酸杂交。
　 （3）探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。
　 （4）避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。
（5）一旦选定某一序列符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。
Q6：合成的寡核苷酸探针具有哪些优点？
A6：（1）由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短，如20 nt的寡核苷酸探针在浓度为100 ng/ml，靶序列为1-100 pg、1 kb片段时，达到最大程度的核酸分子杂交只需10 min，而用2 kb的克隆探针在同样条件下达到完全核酸分子杂交则需16 h。
（2）寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。
（3）一次可大量合成寡核苷酸探针（1-10 mg），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异，但通过细心筛选序列或选择相对长的序列（＞30 nt）也可设计出非常特异的寡核苷酸探针。最常用的寡核苷酸探针有18-40个碱基，目前的合成仪可有效地合成至少50个碱基的探针。