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【原创】[共享] 总RNA的提取方法

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总RNA提取
具体步骤:(关键是防止RNA酶的污染)

1) 称取-85℃冰冻保存的标本50-100mg,于液氮中夹碎(用剪刀将组织块剪成若干碎块)(须避免RNA酶的污染)。
2) 将组织碎块加入1ml TRI zol变性缓冲液中(所加组织块的体积不能超过TRIzol体积的10%),在玻璃匀浆器中充分研磨至无明显大的组织块为止,研磨过程在0℃冰水中进行,以防止组织RNA被降解。
⑵ RNA的分离
3) 然后将组织匀浆液转移到1.5ml的Eppendorf管中,室温静置5min,使核蛋白复合体完全分离。
4) 加入0.2ml的氯仿,盖紧盖子,充分摇匀15秒左右,配平,室温静置2-3min 。
5) 4℃冰冻离心机中离心(12000g/min,15min)。此时可见液体分层:底层——红色酚-氯仿相;中间层——粉红色的交界相;上层——无色液相(RNA全部在此相中)。
⑶ RNA的沉淀
6) RNA仅存于上清中。将上清转移至新管(1.5ml的Eppendorf管)中(切勿将中间层误吸入),
7) 加入0.5ml的异丙醇,充分混匀,配平,室温静置10min。
8) 4℃冰冻离心机中离心(12000g/min,15min)。
9) 弃上清(动作轻,慢),在管底部可见一乳白色小沉淀物,即为RNA。
⑷ RNA的清洗  
10) 加入1ml 75%乙醇,混合震荡,(可在2℃-8℃中保存一周,-15-25℃中保存一年)
11) 4℃冰冻离心机中离心(7500g/min) 5min,弃上清。
⑸ RNA的再溶解
12) 通风,室温中干燥5min-10min,让乙醇挥发(根据肉眼观察管内水分情况,不能太干,RNA干后难溶解)。
13) 加入10ul的0.1%的DEPC处理水溶解RNA。
14) 供下一步实验使用或-70℃冻存。
RNA完整性的检测(应用检测DNA完整性的方法进行):
1) 电泳槽的处理:
做RNA电泳时先用肥皂水洗净,无水乙醇冲洗,自然干燥后用3%双氧水浸泡15分钟,再用DEPC处理水冲洗即可。
做DNA电泳时,先用肥皂水洗净,无水乙醇冲洗,自然干燥后即可使用。
2) 配置5undefinedTAE缓冲液
50×TAE配方:
Tris 24.2 g
冰乙酸 5.71 mL
0.5mol/L EDTA (pH8.0) 10mL -------1.861 g--------NaOH调节PH值到8.0 分子量372.2undefined0.undefined0.01=1.861 g
加DEPC处理水 加至1 00mL 应用时用DEPC处理水稀释50倍使用
3)制备凝胶(1%琼脂糖凝胶)
称取琼脂糖300/500mg,加入1×TAE 30/50ml中,微波炉加热至融化(中火1分钟),冷却至60℃,加入EB嗅已啶(10mg/ml)1.5 /1.8ul,混匀,倒入电泳槽中,室温30分钟以上至凝固,最终配成浓度为1%琼脂糖凝胶。
4)加2 µl 灭菌的并经用DEPC处理的加样缓冲液于10µLRNA样品中,混匀后加样于1%琼脂糖凝胶加样孔中。
加样缓冲液配方:
50%甘油 5ml
1 mmol/L EDTA(PH值8.0) 20ul
0.25%溴酚蓝 25mg
0.25%二甲苯青FF 25mg
5) 在1%的琼脂糖凝胶上进行水平电泳,电压5V/cm,电泳时间约40分钟。
6)在可见/紫外线检测仪254nm紫外光透视下,对结果进行观察。应可见真核细胞核糖体RNA中的28s 和18s RNA 两条清晰条带。所得结果用相机拍摄存档。
个人心得:
研磨组织时用研钵,研钵需事先180度烤8小时,待晾凉后备用
研钵需用液氮预冷,保证研磨组织过程低温操作,最好在液氮中把组织研碎,然后加入TRIZOL提取液(最好为国外进口试剂PROMEGA较好)
称重最好省去避免组织破坏,靠经验估计即可
谢谢
请各位指点
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