生物芯片技术探秘
丁香园论坛
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生物芯片发展至今有很多名称和类型，通常将样品的制备，生化反应、结果的检测和分析这三步不同步骤集成为不同用途的生物芯片，据此分为不同的类型。例如用于样品制备的生物芯片，生化反应生物芯片及各种检测用生物芯片等。基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个生化检测分析过程集成到芯片上以获得微型全分析系统（micro total analytical system）或称所谓的“芯片实验室”（Lab-on-Chip）。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。
（相关的英文名计有：Microarray、BioChip、 BioArray、GeneChip、 DNAChip、DNA Microarray、 Mirofluidics Chip、 Microelectronic Chip、Lab-on-Chip）
样品制备芯片的目的是将通常需要在实验室进行的多个操作步骤集成于微芯片上。目前，样品制备芯片主要通过升温、变压脉冲以及化学裂解等方式对细胞进行破碎，通过微滤器、介电电泳等手段实现生物大分子的分离。
生化反应芯片即在芯片上完成生物化学反应。与传统生化反应过程的区别主要在于它可以高效、快速地完成生物化学反应。例如，在芯片上进行PCR反应，可以节约实验试剂，提高反应速度，并可完成多个片段的扩增反应。通常我们在对微量核酸样品进行检测时必需事先对其进行一定程度的扩增，所以用于PCR的芯片无疑为快速大量扩增样品多个DNA片段提供了有力的工具。
检测芯片顾名思义是用来检测生物样品的。例如用毛细管电泳芯片进行DNA突变的检测，用于表达谱检测、突变分析、多态性测定的DNA微点阵芯片（也称DNA芯片、基因芯片），用于大量不同蛋白检测和表位分析的蛋白或多肽微点阵芯片（也称蛋白或多肽芯片）。
芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它通过微细加工工艺制作的微滤器、微反应器、微泵、微阀门、微电极等将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统，从而极大地缩短的检测和分析时间，节省了实验材料。
现在，已经有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的芯片。例如可以将样品的制备和PCR扩增反应同时完成于一块小小的芯片之上。再如Gene Logic公司设计制造的生物芯片可以从待检样品中分离出DNA或RNA，并对其进行荧光标记，然后当样品流过固定于栅栏状微通道内的寡核苷酸探针时便可捕获与之互补的靶核酸序列。应用其自己开发的检测设备即可实现对杂交结果的检测与分析。这种芯片由于寡核苷酸探针具有较大的吸附表面积，所以可以灵敏地检测到稀有基因的变化。同时，由于该芯片设计的微通道具有浓缩和富集作用，所以可以加速杂交反应，缩短测试时间，从而降低了测试成本。
目前我们最常见的生物芯片要数基因芯片（Gene Chip）。在基因芯片中又要数基因表达谱芯片的应用最为广泛，技术上也最成熟。这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因表达水平的变化，但对芯片点阵的密度要求较高，目前能见到的芯片产品中基因数量从几千到几万不等。表达谱芯片可以分析2组或2组以上不同来源的mRNA转录丰度的差异，通过计算杂交信号的比值(Ratio值)和统计分析，可以获得差异表达基因的信息，同时还可以用聚类分析算法研究在功能或表达调控上具有相关性的基因，最终为研究基因功能和基因遗传网络提供有力手段。表达谱芯片研究流程相对繁杂，包括样本制备、荧光标记、杂交、芯片扫描、芯片图象处理和基因表达信息分析。
基因芯片技术主要包括四个主要步骤：
芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。
芯片制备 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体。通常比较典型的制备方法有3种：（1）原位合成法（2）合成点样法 又根据是否与芯片的表面接触分为化学喷射法和接触式点涂法（3）压电法，从而将靶基因作为探针按顺序排列在载体上。靶基因可分为基因组DNA、cDNA（或人工合成DNA）。目前，以cDNA的研究为主，因为cDNA是染色体上编码蛋白质的DNA序列，有医疗和其他领域的研究价值和商业价值。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。
原位合成法 以Affymetrix公司开发的光引导聚合法为代表，它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术（ photolithography ）与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。照相平板印刷技术由Fordor在Affymetrix公司发展起来。在一块玻璃片上无光罩掩蔽区的光敏基团修饰的脱氧核苷酸取代，之后用光罩保护新的确定区域，再进行上述这过程，如此循环保护和偶联的过程最终在玻璃片上的不同点合成特征性的寡核苷酸。其主要特征是：①可在芯片上根据已知序列原位合成，省去了麻烦的样品处理过程；②使用合成试剂将芯片之间的差异减少到最小；③能得到高密度的阵列。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽阵列提供了一条快捷的途径。以合成寡核苷酸探针为例，该技术主要步骤为：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取择适当的蔽光膜（ mask ）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。例如，合成 48 （ 65536 ） 个探针的 8 聚体寡核苷酸序列仅需 4 × 8=32 步操作， 8 小时就可以完成。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到 106/cm2 。不过，尽管该方法看来比较简单，实际上并非如此。主要原因是，合成反应每步产率比较低，不到 95% 。而通常固相合成反应每步的产率在 99% 以上。因此，探针的长度受到了限制。而且由于每步去保护不很彻底，致使杂交信号比较模糊，信噪比降低。为此有人将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到 98% 。原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，当照度达到特定的阈值以上保护剂就会解离。所以，该方法同时也解决了由于蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。另据报导，利用波长更短的物质波如电子射线去除保护可使点阵密度达到 1010/cm2 。
合成点样法 以Incyte Pharmaceutical公司和Stanford大学为代表．这一方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的 DNA 或多肽固相合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷。生物样品通过虹吸作用载入加样针器，然后通过直接物理接触传送至芯片底物的固相表面。每一轮点击完成后，加样针被彻底冲洗以免交叉污染，然后再载入新的样品开始下一轮打点过程。全部操作由自动控制的机器人系统和多道打印头来完成。该技术首先由Schena、Shalon和Brown在95年发展起来，Synteni公司完成商品化。主要优点是：保持样品原型，操作迅速，成本低廉，用途广泛。缺点是：样品必须预先合成，需要一系列的纯化及储存等后续过程；密度达不到类似照相平板印刷术的水平。不过经过改进的话，最终可在6.5cm2的范围内容纳100000个核酸位点，从而为从事基础研究的实验室广泛采用。现在已有比较成型的点样装置出售，如美国 Biodot 公司的点膜产品以及 Cartesian Technologies 公司的 PixSys NQ/PA 系列产品。
压电打印法 以美国Incyte Pharmaceuticals为代表使用压电打印法进行原位合成。其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。做法是将生化样品加载入袖珍喷嘴（有压电感应装置），如将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂所替代，通过计算机控制在电流控制下喷嘴的有序开放和关闭使得精确量的样品液体喷射在预设的底物位点表面（固定是一个琥珀酰酯代反应过程）。之后喷嘴得到清洗后再加样，如此循环，喷出一系列的阵列来。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为 40 到 50 个碱基的探针，每步产率也较前述方法为高，可达到 99% 以上。）优点：这种方法允许几乎用任何感兴趣的样品做生物芯片，包括cDNA、基因组DNA、抗体和小分子物质；无接触制片、压电式传送理论上允许高速高密度制备，目前可做到10000cDNA/cm2，非常适合于做基因组分析。
样品制备 生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，而且由于灵敏度所限，多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程序的提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。 目前，不过也有不少人试图绕过这一问题，如 Mosaic Technologies 公司引入的固相 PCR 方法，引物特异性强，无交叉污染并且省去了液相处理的烦琐； Lynx Therapeutics 公司引入的大规模并行固相克隆法 (Massively parallel solid-phase cloning) ，可在一个样品中同时对数以万计的 DNA 片段进行克隆，且无需单独处理和分离每个克隆。
杂交反应和信号检测 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。在杂交反应完成后，将矩阵插入杂交模式被检测的扫描仪中。当已经结合在目标上的荧光发出光时，杂交数据就被收集了。探针与目标明显地相匹配时通常产生的信号比不匹配的要强。既然在矩阵上每个探针的序列和位置是已知的，应用探针矩阵，目标核苷酸的特性就能被确定了。
显色和分析测定方法主要为荧光法，其重复性较好，不足的是灵敏度仍较低。目前正在发展的方法有质谱法、化学发光法、光导纤维法等。以荧光法为例，当前主要的检测手段是激光共聚焦显微扫描技术，以便于对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全正常配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的 5-35 倍，所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础。但荧光法存在的问题是，只要标记的样品结合到探针阵列上后就会发出阳性信号，这种结合是否为正常配对，或正常配对与错配兼而有之，该方法本身并不能提供足够的信息进行分辨。 对于以核酸杂交为原理的检测技术，荧光检测法的主要过程为：首先用荧光素标记扩增（也可以有其它放大技术）过的靶序列或样品，然后与芯片上的大量探针进行杂交，将未杂交的分子洗去（如果用实时荧光检测可省去此步 ）这时，用落射荧光显微镜或其它荧光显微装置对片基进行扫描，采集每点荧光强度并对其进行分析比较。前已述及，由于正常的 Watson-Crick 配对双链要比具有错配碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性。所以，如果探针与样品分子在不位点配对有差异则该位点荧光强度就会有所不同，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。当然，由于检测原理及目的不同，样品及数据的处理也自然有所不同，甚至由于每种方法的优缺点各异以至于分析结果不尽一致。除了以上常用的检测方式外，还有一种思路上很新颖的方法，叫光纤DNA生物传感器微阵列（fiber-optic DNA biosensor microarray)，将生物传感器与微阵列的优势结合了起来。它是将合成的氰尿酰氯活化的寡核苷酸探针固定在直径200um的光导纤维的末端上（传感器敏感膜），然后若干固定有不同探针的光导纤维合成一束，形成一个微阵列的传感装置，其探针末端可以伸入样品溶液中，杂交的荧光信号由另一偶联的CCD相机接受。整个操作分析可以在5 min内完成。而且传感器敏感膜还可以经过洗涤后再生利用。这咱将传感器与微阵列结合起来的方法特别便于操作杂交分析不方便的环境和不具备激光共聚焦显微镜这样昂贵检测设备的地方，如临床检测诊断，对于普及并行的多基因分析有重要的意义。
（相关的英文名计有：Microarray、BioChip、 BioArray、GeneChip、 DNAChip、DNA Microarray、 Mirofluidics Chip、 Microelectronic Chip、Lab-on-Chip）
样品制备芯片的目的是将通常需要在实验室进行的多个操作步骤集成于微芯片上。目前，样品制备芯片主要通过升温、变压脉冲以及化学裂解等方式对细胞进行破碎，通过微滤器、介电电泳等手段实现生物大分子的分离。
生化反应芯片即在芯片上完成生物化学反应。与传统生化反应过程的区别主要在于它可以高效、快速地完成生物化学反应。例如，在芯片上进行PCR反应，可以节约实验试剂，提高反应速度，并可完成多个片段的扩增反应。通常我们在对微量核酸样品进行检测时必需事先对其进行一定程度的扩增，所以用于PCR的芯片无疑为快速大量扩增样品多个DNA片段提供了有力的工具。
检测芯片顾名思义是用来检测生物样品的。例如用毛细管电泳芯片进行DNA突变的检测，用于表达谱检测、突变分析、多态性测定的DNA微点阵芯片（也称DNA芯片、基因芯片），用于大量不同蛋白检测和表位分析的蛋白或多肽微点阵芯片（也称蛋白或多肽芯片）。
芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它通过微细加工工艺制作的微滤器、微反应器、微泵、微阀门、微电极等将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统，从而极大地缩短的检测和分析时间，节省了实验材料。
现在，已经有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的芯片。例如可以将样品的制备和PCR扩增反应同时完成于一块小小的芯片之上。再如Gene Logic公司设计制造的生物芯片可以从待检样品中分离出DNA或RNA，并对其进行荧光标记，然后当样品流过固定于栅栏状微通道内的寡核苷酸探针时便可捕获与之互补的靶核酸序列。应用其自己开发的检测设备即可实现对杂交结果的检测与分析。这种芯片由于寡核苷酸探针具有较大的吸附表面积，所以可以灵敏地检测到稀有基因的变化。同时，由于该芯片设计的微通道具有浓缩和富集作用，所以可以加速杂交反应，缩短测试时间，从而降低了测试成本。
目前我们最常见的生物芯片要数基因芯片（Gene Chip）。在基因芯片中又要数基因表达谱芯片的应用最为广泛，技术上也最成熟。这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因表达水平的变化，但对芯片点阵的密度要求较高，目前能见到的芯片产品中基因数量从几千到几万不等。表达谱芯片可以分析2组或2组以上不同来源的mRNA转录丰度的差异，通过计算杂交信号的比值(Ratio值)和统计分析，可以获得差异表达基因的信息，同时还可以用聚类分析算法研究在功能或表达调控上具有相关性的基因，最终为研究基因功能和基因遗传网络提供有力手段。表达谱芯片研究流程相对繁杂，包括样本制备、荧光标记、杂交、芯片扫描、芯片图象处理和基因表达信息分析。
基因芯片技术主要包括四个主要步骤：
芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。
芯片制备 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体。通常比较典型的制备方法有3种：（1）原位合成法（2）合成点样法 又根据是否与芯片的表面接触分为化学喷射法和接触式点涂法（3）压电法，从而将靶基因作为探针按顺序排列在载体上。靶基因可分为基因组DNA、cDNA（或人工合成DNA）。目前，以cDNA的研究为主，因为cDNA是染色体上编码蛋白质的DNA序列，有医疗和其他领域的研究价值和商业价值。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。
原位合成法 以Affymetrix公司开发的光引导聚合法为代表，它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术（ photolithography ）与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。照相平板印刷技术由Fordor在Affymetrix公司发展起来。在一块玻璃片上无光罩掩蔽区的光敏基团修饰的脱氧核苷酸取代，之后用光罩保护新的确定区域，再进行上述这过程，如此循环保护和偶联的过程最终在玻璃片上的不同点合成特征性的寡核苷酸。其主要特征是：①可在芯片上根据已知序列原位合成，省去了麻烦的样品处理过程；②使用合成试剂将芯片之间的差异减少到最小；③能得到高密度的阵列。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽阵列提供了一条快捷的途径。以合成寡核苷酸探针为例，该技术主要步骤为：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取择适当的蔽光膜（ mask ）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。例如，合成 48 （ 65536 ） 个探针的 8 聚体寡核苷酸序列仅需 4 × 8=32 步操作， 8 小时就可以完成。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到 106/cm2 。不过，尽管该方法看来比较简单，实际上并非如此。主要原因是，合成反应每步产率比较低，不到 95% 。而通常固相合成反应每步的产率在 99% 以上。因此，探针的长度受到了限制。而且由于每步去保护不很彻底，致使杂交信号比较模糊，信噪比降低。为此有人将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到 98% 。原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，当照度达到特定的阈值以上保护剂就会解离。所以，该方法同时也解决了由于蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。另据报导，利用波长更短的物质波如电子射线去除保护可使点阵密度达到 1010/cm2 。
合成点样法 以Incyte Pharmaceutical公司和Stanford大学为代表．这一方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的 DNA 或多肽固相合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷。生物样品通过虹吸作用载入加样针器，然后通过直接物理接触传送至芯片底物的固相表面。每一轮点击完成后，加样针被彻底冲洗以免交叉污染，然后再载入新的样品开始下一轮打点过程。全部操作由自动控制的机器人系统和多道打印头来完成。该技术首先由Schena、Shalon和Brown在95年发展起来，Synteni公司完成商品化。主要优点是：保持样品原型，操作迅速，成本低廉，用途广泛。缺点是：样品必须预先合成，需要一系列的纯化及储存等后续过程；密度达不到类似照相平板印刷术的水平。不过经过改进的话，最终可在6.5cm2的范围内容纳100000个核酸位点，从而为从事基础研究的实验室广泛采用。现在已有比较成型的点样装置出售，如美国 Biodot 公司的点膜产品以及 Cartesian Technologies 公司的 PixSys NQ/PA 系列产品。
压电打印法 以美国Incyte Pharmaceuticals为代表使用压电打印法进行原位合成。其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。做法是将生化样品加载入袖珍喷嘴（有压电感应装置），如将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂所替代，通过计算机控制在电流控制下喷嘴的有序开放和关闭使得精确量的样品液体喷射在预设的底物位点表面（固定是一个琥珀酰酯代反应过程）。之后喷嘴得到清洗后再加样，如此循环，喷出一系列的阵列来。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为 40 到 50 个碱基的探针，每步产率也较前述方法为高，可达到 99% 以上。）优点：这种方法允许几乎用任何感兴趣的样品做生物芯片，包括cDNA、基因组DNA、抗体和小分子物质；无接触制片、压电式传送理论上允许高速高密度制备，目前可做到10000cDNA/cm2，非常适合于做基因组分析。
样品制备 生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，而且由于灵敏度所限，多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程序的提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。 目前，不过也有不少人试图绕过这一问题，如 Mosaic Technologies 公司引入的固相 PCR 方法，引物特异性强，无交叉污染并且省去了液相处理的烦琐； Lynx Therapeutics 公司引入的大规模并行固相克隆法 (Massively parallel solid-phase cloning) ，可在一个样品中同时对数以万计的 DNA 片段进行克隆，且无需单独处理和分离每个克隆。
杂交反应和信号检测 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。在杂交反应完成后，将矩阵插入杂交模式被检测的扫描仪中。当已经结合在目标上的荧光发出光时，杂交数据就被收集了。探针与目标明显地相匹配时通常产生的信号比不匹配的要强。既然在矩阵上每个探针的序列和位置是已知的，应用探针矩阵，目标核苷酸的特性就能被确定了。
显色和分析测定方法主要为荧光法，其重复性较好，不足的是灵敏度仍较低。目前正在发展的方法有质谱法、化学发光法、光导纤维法等。以荧光法为例，当前主要的检测手段是激光共聚焦显微扫描技术，以便于对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全正常配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的 5-35 倍，所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础。但荧光法存在的问题是，只要标记的样品结合到探针阵列上后就会发出阳性信号，这种结合是否为正常配对，或正常配对与错配兼而有之，该方法本身并不能提供足够的信息进行分辨。 对于以核酸杂交为原理的检测技术，荧光检测法的主要过程为：首先用荧光素标记扩增（也可以有其它放大技术）过的靶序列或样品，然后与芯片上的大量探针进行杂交，将未杂交的分子洗去（如果用实时荧光检测可省去此步 ）这时，用落射荧光显微镜或其它荧光显微装置对片基进行扫描，采集每点荧光强度并对其进行分析比较。前已述及，由于正常的 Watson-Crick 配对双链要比具有错配碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性。所以，如果探针与样品分子在不位点配对有差异则该位点荧光强度就会有所不同，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。当然，由于检测原理及目的不同，样品及数据的处理也自然有所不同，甚至由于每种方法的优缺点各异以至于分析结果不尽一致。除了以上常用的检测方式外，还有一种思路上很新颖的方法，叫光纤DNA生物传感器微阵列（fiber-optic DNA biosensor microarray)，将生物传感器与微阵列的优势结合了起来。它是将合成的氰尿酰氯活化的寡核苷酸探针固定在直径200um的光导纤维的末端上（传感器敏感膜），然后若干固定有不同探针的光导纤维合成一束，形成一个微阵列的传感装置，其探针末端可以伸入样品溶液中，杂交的荧光信号由另一偶联的CCD相机接受。整个操作分析可以在5 min内完成。而且传感器敏感膜还可以经过洗涤后再生利用。这咱将传感器与微阵列结合起来的方法特别便于操作杂交分析不方便的环境和不具备激光共聚焦显微镜这样昂贵检测设备的地方，如临床检测诊断，对于普及并行的多基因分析有重要的意义。
