生物芯片技术

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生物芯片技术 是近年来兴起的一项综合性的高新技术，它以微机电系统技术和生物技术为依托，将生命科学研究中的许多不连续过程（如样品制备、生化反应、检测等步骤）集成并移植到一块普通邮票大小的芯片上去，并使这些分散的过程连续化、微型化，以实现对大量生物信息进行快速、并行处理的要求。


生物芯片概念的提出受到了计算机芯片的启发。狭义的生物芯片是指包埋在固相载体（如硅片、玻璃和塑料等）上的高密度ＤＮＡ、蛋白质、细胞等微阵列芯片，如ｃＤＮＡ微阵列、寡核苷酸 微阵列和蛋白质微阵列等。这些微阵列由生物活性物质以点阵的形式有序地固定在固相载体上形成。在一定的条件下进行生化反应，将反应结果用化学荧光法、酶标法、电化学法显示，然后用专用的生物芯片扫描仪或电子信号检测仪采集数据，最后通过专门的计算机软件进行数据分析。广义的生物芯片是指任何能对生物分子进行快速并行处理和分析的微型固体薄型器件。


自从１９９１年福多尔（Ｓ． Ｐ． Ａ． Ｆｏｄｏｒ）等人提出ＤＮＡ芯片至今，以ＤＮＡ芯片为代表的生物芯片技术已经得到了快速的发展。目前生物芯片技术除了ＤＮＡ芯片技术外，还包括免疫 芯片分析技术、芯片核酸扩增技术、细胞芯片分析技术和以芯片为平台的高通量药物筛选技术等。这些新兴技术的出现将为生命科学研究、疾病诊断与治疗、新药开发、国防、司法鉴定、食品卫生检验、航空航天等领域带来一场革命。正是由于生物芯片技术的飞速发展，美国科学促进协会将其评为１９９８年科技十大突破之一。


样品制备芯片


生物样品往往是复杂的混合物，在大多数情况下需要先对生物样品进行预处理，即样品制备。以核酸样品制备为例，它包括了细胞分离、破胞、脱蛋白、提取ＤＮＡ等多步工作。这些工作可以在样品制备芯片上完成。目前在细胞分离方法上较突出的有过滤分离和介电电泳分离等；芯片中的破胞方法有芯片升温破胞、高压脉冲破胞以及化学破胞等。


过滤分离芯片


过滤分离即根据生物颗粒的尺寸差异进行分离。针对人白细胞的分离，１９９８年美国宾夕法尼亚大学的研究小组研究出了一种芯片微过滤法。芯片微过滤器的工作原理是根据人白细胞的尺寸比红细胞大的特点，使人外周血流过微过滤器时只让血浆和尺寸较小的红血细胞及血小板通过，而截住尺寸较大的白细胞。加工微过滤用芯片是通过在硅片上刻出各种形状的过滤通道，通道直径为几个微米，然后再在硅芯片上键合上一块玻璃盖片而完成。通过反复试验和设计，微芯片过滤器已从最初的竖式Ｚ形结构，通过竖式条状梳式结构过渡最后定型为横坝式结构。采用横坝式结构的优点是人白细胞的回收率高，过滤器不易被堵塞。微芯片过滤器的另一应用是它可将孕妇外周血中极少量的胎儿细胞过滤出来，供下一步作产前诊断之用。


介电电泳分离芯片


介电电泳分离的原理是细胞在高频不均匀电场作用下产生极化，不同的细胞由于介电特性、电导率、形状不同而感应出不同的偶电极，因此受到不同介电力的作用。利用介电电泳方法制备样品的优点是：通过测量细胞的运动速度，可以得到细胞的介电特性；可以对细胞进行无物理接触的选择性操纵、定位、分离。


生化反应芯片


生化反应芯片的目的是把在实验室试管中进行的生化实验缩微到一块小小的芯片上。目前较典型的生化反应芯片包括聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃ-ｔｉｏｎ，ＰＣＲ）芯片、药物合成芯片等，其中ＰＣＲ扩增芯片是生化反应芯片的典型代表。


在芯片上进行ＰＣＲ扩增反应的背景是，目前在生物芯片领域中所用的检测仪器灵敏度还不够高，所以从血液或活体组织中提取的ＤＮＡ在标记或应用前都需要扩增复制。例如，在对一个肿瘤的活体解剖样品进行检测时，需要在几千个正常基因中找到一个异常的癌基因，显然这需要对样品ＤＮＡ进行必要的扩增复制才易于检测。ＰＣＲ作为生物学中最常用的ＤＮＡ扩增手段，由变性、延伸、退火三个步骤所构成，其每个步骤的工作温度大约分别为９５℃、７２℃、６０℃。通过该反应可将极微量的ＤＮＡ成千上万倍地扩增，以满足实验需要。


除了上述方法外，另一个更简易的方法是将帕尔帖器件（一种可通过改变器件两端电压的极性而产生加热或致冷效果的半导体器件），直接贴在ＰＣＲ扩增芯片的背面，人们只需控制帕尔帖器件的温度在三个恒温区之间变化，就能在芯片上实现ＰＣＲ扩增。


检 测 芯 片


检测芯片主要包括毛细管电泳芯片和微阵列芯片两类。


毛细管电泳芯片


毛细管电泳（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＥ）对于ＤＮＡ测序、司法鉴定、ＰＣＲ产物分析来说是一个强有力的手段。与平板凝胶电泳相比，毛细管电泳能更快速、更准确地分离ＤＮＡ片段，这是因为可以在毛细管两端加上更高的电压。毛细管电泳的缺点是一次只能分析一个样品，毛细管微阵列电泳将平板凝胶电泳和毛细管电泳两种方法的优点结合起来，在毛细管微阵列上并行地进行电泳，它能增大电泳泳道数目、提高电泳速度，是一种有着巨大应用前景的方法。


在毛细管电泳的基础上，近几年发展出集成度更高的集成毛细管电泳技术。集成毛细管电泳技术是在硅、玻璃、塑料等基体上刻蚀出毛细管槽，用盖板封闭好后，在毛细管中填入媒体，使电泳分离的整个过程集成到一块几平方厘米的基片上。集成毛细管电泳芯片具有高效、快速、试样用量少等优点，并已经在免疫测定、ＤＮＡ分析和测序、氨基酸和蛋白质分析、生物细胞研究方面得到应用。


伍利（Ａ． Ｔ． Ｗｏｏｌｌｅｙ）等人报道的方法，利用光刻掩膜和化学刻蚀技术在玻璃基底上光刻出微通道阵列，然后使基底与另一块玻璃片键合构成毛细管阵列，其中上层玻璃片上钻有小孔作为样品输入孔。ＤＮＡ片段在缓冲液中被荧光标记，最后利用激光共焦荧光探测系统检测毛细管电泳的结果。


拉加利（Ｅ． Ｔ． Ｌａｇａｌｌｙ）等人构建了一种将ＰＣＲ反应和毛细管电泳集成在一起的ＰＣＲ－ＣＥ器件。他们将热循环所需的加热元件直接微加工在器件上，升温／降温的速度为每秒１０℃，每一次ＰＣＲ热循环的时间为３０秒，利用５０纳升容量的微阀和疏水性出口将样品输运到２００纳升容量的ＰＣＲ反应腔中。基于该集成化ＰＣＲ－ＣＥ器件，能够实现对单个ＤＮＡ分子的扩增和检测。


此外刘英杰等人还构建了一种基于聚碳酸酯材料的集成毛细管器件来分析ＤＮＡ样品。他们利用压模方法加工出毛细管微通道，聚碳酸酯材料在键合前接受了紫外线辐射以增强亲水性。实验表明该器件能显著区分长度为１００个碱基对、２００个碱基对……１５００个碱基对等的ＤＮＡ片断。


微阵列芯片


ＤＮＡ微阵列芯片基于ＤＮＡ杂交反应的原理，先将许多ＤＮＡ片段末端固定在芯片上，然后让荧光标记的样品核酸通过流路或加样至芯片上，杂交反应结束后清洗芯片，留在芯片上的样品核酸即可用荧光检测的方法来检测。由于ＤＮＡ微阵列芯片不要求先对基底做微细加工，因此可利用自动化或化学合成方法在基底上直接施加或合成生化物质。目前有４种典型的ＤＮＡ微阵列芯片制备方法：光引导原位合成法、接触式点涂法、化学喷射法、压电喷射原位合成法。


光引导原位合成法是将微电子工业中的光刻技术与ＤＮＡ的光化学合成方法相结合。首先把用光敏保护基团保护的４种核苷酸固定在玻片上，然后根据设计要求用不同的掩模板对玻片进行掩蔽，光照处的光敏保护基团分解，暴露的地方即可加上新的被保护的核苷酸，如此循环下去就能以很高的密度和精度来制备ＤＮＡ微阵列芯片。现在人们已经能在１．６厘米２的玻片上合成４０万组寡核苷酸。这种方法的缺点是需要花费大量的时间和成本来制备掩模板，因为寡核苷酸的每个碱基位需要４块掩模板，合成一个２５个碱基对的微阵列芯片就需要１００块掩模板。


接触式点涂法先将ＤＮＡ探针合成好，然后通过一个点接触装置自动地将探针点到玻片上的指定地点。点接触法的优点是快速、经济、多功能，缺点是每种样品都必须是合成好、经过纯化并事先保存的。


化学喷射法是以定滴供给的方式，通过压电晶体或其他推进形式从喷嘴内将生物样品喷射到玻璃基片上。喷射法所需的样品是已经合成好的ＤＮＡ，它与点接触法的区别是喷嘴不与玻片接触。


压电喷射原位合成法主要包括两个步骤：先在直径为７５毫米的二氧化硅基底上制备高密度的小坑，每个小坑的直径为１００微米，间距３０微米，共约１０万个小坑，小坑内作羟基化亲水处理，小坑间作氟化疏水处理，这样得到的小坑即可作为ＤＮＡ合成的微型反应池；然后根据实际要求，在４个压电喷头中分别装入Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ核苷酸，由计算机控制微阵列ＤＮＡ芯片ｘ－ｙ方向的运动，将４种核苷酸喷射到适当的小坑中，由此在预制的基底上并行合成出微阵列ＤＮＡ芯片。


生物芯片中的微流体技术


在生物、化学、材料等科学实验中，经常需要对流体进行操作，如样品ＤＮＡ的制备、ＰＣＲ反应、电泳检测等操作都是在液相环境中进行。如果要将样品制备、生化反应、结果检测等步骤集成到生物芯片上，则实验所用流体的量就从毫升、微升级降至纳升或皮升级，这时功能强大的微流体装置就显得必不可少了。因此随着生物芯片技术的发展，微流体技术作为生物芯片的一项关键支撑技术也得到了人们越来越多的关注。


与微电子技术不同，微流体技术不强调减小器件的尺寸，它着重于构建微流体通道系统来实现各种复杂的微流体操纵功能。与宏观流体系统类似，微流体系统所需的器件也包括泵、阀、混合器、过滤器、分离器等。尽管与微电子器件相比，微通道的尺寸显得相当大，但实际上这个尺寸对于流体而言已经是非常小。微通道中的流体流动行为与人们在日常生活中所见的宏观流体流动行为有着本质的差别，因此微泵、微阀、微混合器、微过滤器、微分离器等微型器件往往都与相应的宏观器件差别甚大。


为了精确设计微流体系统中所需的器件，首先要确定微通道中流体的流动性质。现在人们利用共焦显微镜成像技术可以方便地对微通道中的流动过程进行量化，达到了以往无法实现的高分辨率。世界上第一个微流体器件由英国帝国理工大学（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ）的曼齐（Ａ． Ｍａｎｚ）、美国橡树岭国家实验室的拉姆齐（Ｍ． Ｒａｍｓｅｙ）等科学家在１９９０年代初研制成功。该器件是利用常规的平面加工工艺（光刻、腐蚀等）在硅、玻璃上制作的。尽管这种制作方法非常精密，但成本高，且不灵活，无法适应研发需求。最近怀特赛兹（Ｇ． Ｍ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）等人提出一种“软光刻”微加工方法，即在有机材料上印制、成型出微结构，从而能方便地加工原型器件和专用器件。另外这个方法还能构建出三维微通道结构，并能在更高层次上控制微流体通道表面的分子结构。


喷射技术是最成熟的微流体技术，它使用直径小于１００微米的孔来产生微滴。这项技术可用于输运微反应中的微量试剂，以及将微量ＤＮＡ样品分发到载体表面形成微阵列（参见ＤＮＡ芯片制作中的化学喷射法、压电喷射原位合成法）。前面提到的集成毛细管电泳技术也是近几年出现的另一项微流体技术。


生物芯片的光学检测和数据处理


对ＤＮＡ芯片上所包含的信息进行准确检测是一项至关重要的工作。早期的方法是同位素标记法，应用时需经过曝光、显影，然后用具有寻址功能的扫描仪扫读。目前在生物芯片信息采集中使用最多最成功的是荧光标记法，这种方法不受同位素的使用限制，用激光作为激发光源的共焦扫描装置具有极高的灵敏度、分辨能力和定位功能，并能定量地输出结果。


最近纳马西瓦亚姆（Ｖ． Ｎａｍａｓｉｖａｙａｍ）等人构建了一种将荧光检测装置直接集成在生物芯片上的方法，这更加提高了生物芯片的集成度。他们在硅上加工出光电二极管，并与芯片上的微流体系统相结合，可以实现０．９纳克／微升的ＤＮＡ检测精度，信噪比为１００∶１。


由于利用生物芯片可以一次性地得到大量实验数据，因此需要一个专用的软件系统来处理数据。完整的生物芯片数据处理系统，应该包括芯片图像分析和数据提取，芯片数据的统计学分析和生物学分析，芯片的数据库积累和管理，芯片表达基因的国际互联网检索，表达基因数据库分析和积累等功能。


生物芯片应用


在功能基因组学中的应用


研究表明，在不同的组织中表达基因的数目差别非常大，脑中基因表达的数目最多，约有３～４万个，而有的组织中只有几十个基因表达。不能准确知道每种组织中表达基因的数目以及每个基因的表达量，就无法从分子水平上了解这一组织在生命活动中的功能。另外同一组织在不同的生长发育阶段中基因表达的种类、数量也不同，有些基因是在幼年期表达的，而有些基因是在老年期表达的。因此人们不但需要了解基因的序列，还要了解基因在不同组织、不同时间中基因的表达谱，这引发了功能基因组学的诞生。


功能基因组学研究的是在特定组织中、发育的不同阶段或者是疾病的不同时期基因的表达情况，因此它要求能在同一时刻获得多个分子遗传学分析的结果；另外，任何一个细胞中都会有上千个基因在表达。而细胞间基因表达的差异往往能反应出这些细胞是正常发育还是在朝恶性肿瘤细胞方向发展。采用生物芯片技术利用核酸杂交对基因表达进行并行分析的好处是，它用很少的细胞物质便能提供有关多基因差异表达的信息，从而给功能基因组学研究提供前所未有的信息量。


作为超高通量药物筛选平台的应用


在过去的十多年中，随着科技的不断进步以及在巨大的经济利益驱使下，药物筛选技术得到了很大的发展。在１９８０年代中期，每天只能筛选３０种化合物，到了１９９０年代中期，每天可筛选１５００种化合物，而如今每天可筛选超过１０万个化合物。高速、低成本的高通量筛选已经成为当今药物筛选的主流，并逐渐向超高通量方向发展。要进一步提高筛选效率，目前的高通量筛选技术在各方面均需要技术创新，这为生物芯片技术进入药物筛选领域提供了宝贵的契机。


实现超高通量筛选有两条途径：微型化和自动化。生物芯片作为一种新型技术平台，正可满足超高通量筛选的微型化、自动化需要。


在毒理学研究中的应用


对药物进行毒性评价，是药物筛选过程中十分重要的一个环节。现在毒理学家多采用小鼠作为模型，通过动物实验来确定药物的潜在毒性。这些方法需要使用大剂量的药物，花几年的时间，代价巨大。ＤＮＡ芯片技术可将药物毒性与基因表达特征联系起来，通过对基因表达情况的分析来确定药物毒性，使得药物毒性或其他不希望出现的效应在临床实验前得以确认。用ＤＮＡ芯片可以在一个实验中同时对成千上万个基因的表达情况进行分析，从而可为研究化学分子或药物分子对生物系统的作用提供全新的线索。


该技术可对单个或多个有害物质进行分析，确定化学物质在低剂量条件下的毒性，分析推断有毒物质对不同生物的毒性可比性。如果不同类型的有毒物质所对应的基因表达谱有特征性的规律，那么通过比较对照样品和有毒物质的基因表达谱，就可以对各种有毒物质进行分类。在此基础上通过进一步建立合适的生物模型系统，便可通过基因表达谱的变化来反映药物对人体的毒性。


虽然生物芯片技术是一项新兴的技术,但是由于其巨大的应用前景，它已经成为各国工业界和学术界竞相研究的热点。随着生物芯片制作工艺和检测分析手段的不断进步，可以预期在不远的将来，生物芯片技术将渗透到生命科学研究、疾病诊断与治疗、新药开发、国防、司法鉴定、食品卫生检验、航空航天等各个领域中去，成为科学家探索未知世界奥秘的有力武器。