【共享】全球各实验室如何进行RNAi实验
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全球各实验室如何进行RNAi实验？
（3）病毒入侵者（Viral Invaders）
使用者：南阿拉巴马州立大学微生物学和免疫学教授Sailen Barik
项目：敲除编码呼吸融合病毒 (Respiratory Syncytial Virus，RSV) 功能亚基的基因，抑制病毒在小鼠体内繁殖
问题：在确保草案全面试实施的同时，用化学修饰法和27mer链拧动以油脂为基础的传递
方法：鼻内递送绑定阳离子脂质转染试剂递的siRNAs。Barik说：“对于呼吸病毒来说，这是最好的途径，因为其基本上停留在肺中，不会扩散到其他部位。”裸siRNA依然有效，但效率低。接着，研究人员对其进行化学修饰，但在决定对siRNA修饰的位点时却饰遇到了挑战，之前有作用的试剂在修饰后有时会无效。他们还尝试了27mer链，Barik说结果没有明显改善。
优点：肺提供了一个有效的传递途径
缺点：改变一个参数意味着需要重新优化草案
底线：整合的许多诀窍都需要修补，已公布的草案不一定能够提供多大帮助。“我认为现在应该将病毒的化学修饰与27mer结合起来，检测它们在动物体内的效果，”Barik说，化学修饰通常有效，“但需要计算出适合所用系统的位点。”更何况，将递送试剂与化学修饰结合起来会“抛弃全部的递送关系。”
（4）载体敲除（Vector Knockdown）
使用者：斯坦福大学研究生Daniel Paskowitz
项目：敲除成体大鼠视网膜中的基因，研究视网膜病变
问题：维持遗传表达的稳定性
途径：Paskowitz利用腺相关病毒（adeno-associated viral ，AAV）载体将shRNA递送到视网膜中。Paskowitz说DNA能够以一种比siRNA更稳定的方式被递送到细胞内。尽管大多数AAV载体的表达需要2－4周，但利用一种许多实验室发展的强启动子将表达时间缩短到几天内。
优点：shRNA提供更稳定的组织靶向性；使用者可以转换不同的编码RNAs，最优化病毒递送草案；有细胞特异性的病毒可用于靶向
缺点：敲除效果不稳定；克隆病毒载体比直接的siRNA需要的时间长；许多病毒载体需要时间表达
底线：“不是所有的shRNA都是相同的，”Paskowitz说，“预测哪个有效、哪个无效，仍然是一个不完整的科学。”不同病毒有不同的表达时长，但在视网膜中，AAV递送的基因表达基本上是持久的。虽然Paskowitz实验中使用的器官容易获得，但病毒递送仍比大多数siRNA方法灵活。某些AAV特异感染光感受器，其它的有些会转向色素细胞，而且该方法理论上可以靶向截然不同的细胞类型。
（5）全面敲除取代（Full-on Knockout Replacement）
使用者：哈佛大学医学院非肥胖型糖尿病小鼠中心管理员John Stockton
项目：制造可遗传的基因敲除，如与I型糖尿病有关的CELA4
问题：几个插入位点之间的干扰和表达结果不稳定
方法：“与普通转染过程相似，”Stockton说，“但这里，因为有几个插入位点，表达变得更加不稳定。” Stockton与其同事通过显微注射，利用慢病毒载体将小发卡RNAi递送到小鼠胚胎，然后将这些胚胎移植到pregnancy-primed雌鼠。雌鼠所分娩的后代体内，靶基因被部分敲除。
优点：可遗传的、永久的基因效果；比制造敲除快3倍；适用范围广，除小鼠外还可用于鸟、鱼、大鼠、家畜
缺点：不完全敲除；表达率不稳定；慢病毒需要的生物安全等级为2，操作要小心
底线：编码RNAi的病毒载体赋予了传统敲除的近似速度。目前只能部份阻断靶基因的功能，然而，该技术不仅更快而且更有效。成功率接近30%，比核内注射（pronuclear injection）的效率高，Stockton认为，10％－40％的细胞构建成功，可变性就会在后代中稳定下来。
（3）病毒入侵者（Viral Invaders）
使用者：南阿拉巴马州立大学微生物学和免疫学教授Sailen Barik
项目：敲除编码呼吸融合病毒 (Respiratory Syncytial Virus，RSV) 功能亚基的基因，抑制病毒在小鼠体内繁殖
问题：在确保草案全面试实施的同时，用化学修饰法和27mer链拧动以油脂为基础的传递
方法：鼻内递送绑定阳离子脂质转染试剂递的siRNAs。Barik说：“对于呼吸病毒来说，这是最好的途径，因为其基本上停留在肺中，不会扩散到其他部位。”裸siRNA依然有效，但效率低。接着，研究人员对其进行化学修饰，但在决定对siRNA修饰的位点时却饰遇到了挑战，之前有作用的试剂在修饰后有时会无效。他们还尝试了27mer链，Barik说结果没有明显改善。
优点：肺提供了一个有效的传递途径
缺点：改变一个参数意味着需要重新优化草案
底线：整合的许多诀窍都需要修补，已公布的草案不一定能够提供多大帮助。“我认为现在应该将病毒的化学修饰与27mer结合起来，检测它们在动物体内的效果，”Barik说，化学修饰通常有效，“但需要计算出适合所用系统的位点。”更何况，将递送试剂与化学修饰结合起来会“抛弃全部的递送关系。”
（4）载体敲除（Vector Knockdown）
使用者：斯坦福大学研究生Daniel Paskowitz
项目：敲除成体大鼠视网膜中的基因，研究视网膜病变
问题：维持遗传表达的稳定性
途径：Paskowitz利用腺相关病毒（adeno-associated viral ，AAV）载体将shRNA递送到视网膜中。Paskowitz说DNA能够以一种比siRNA更稳定的方式被递送到细胞内。尽管大多数AAV载体的表达需要2－4周，但利用一种许多实验室发展的强启动子将表达时间缩短到几天内。
优点：shRNA提供更稳定的组织靶向性；使用者可以转换不同的编码RNAs，最优化病毒递送草案；有细胞特异性的病毒可用于靶向
缺点：敲除效果不稳定；克隆病毒载体比直接的siRNA需要的时间长；许多病毒载体需要时间表达
底线：“不是所有的shRNA都是相同的，”Paskowitz说，“预测哪个有效、哪个无效，仍然是一个不完整的科学。”不同病毒有不同的表达时长，但在视网膜中，AAV递送的基因表达基本上是持久的。虽然Paskowitz实验中使用的器官容易获得，但病毒递送仍比大多数siRNA方法灵活。某些AAV特异感染光感受器，其它的有些会转向色素细胞，而且该方法理论上可以靶向截然不同的细胞类型。
（5）全面敲除取代（Full-on Knockout Replacement）
使用者：哈佛大学医学院非肥胖型糖尿病小鼠中心管理员John Stockton
项目：制造可遗传的基因敲除，如与I型糖尿病有关的CELA4
问题：几个插入位点之间的干扰和表达结果不稳定
方法：“与普通转染过程相似，”Stockton说，“但这里，因为有几个插入位点，表达变得更加不稳定。” Stockton与其同事通过显微注射，利用慢病毒载体将小发卡RNAi递送到小鼠胚胎，然后将这些胚胎移植到pregnancy-primed雌鼠。雌鼠所分娩的后代体内，靶基因被部分敲除。
优点：可遗传的、永久的基因效果；比制造敲除快3倍；适用范围广，除小鼠外还可用于鸟、鱼、大鼠、家畜
缺点：不完全敲除；表达率不稳定；慢病毒需要的生物安全等级为2，操作要小心
底线：编码RNAi的病毒载体赋予了传统敲除的近似速度。目前只能部份阻断靶基因的功能，然而，该技术不仅更快而且更有效。成功率接近30%，比核内注射（pronuclear injection）的效率高，Stockton认为，10％－40％的细胞构建成功，可变性就会在后代中稳定下来。
