【共享】大量质粒抽提 给像我一样在穷实验室工作的新手
丁香园
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质粒DNA的大量提取和纯化
在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
（一）、碱法
1、取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液400ml，4℃下5000转离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。
2、称重一般为3-4g.
2、将细菌沉淀物重新悬浮于4ml/1g溶液I中,充分悬浮菌体细胞。(该步骤很重要，悬浮不充分直接影响到细菌的裂解效果，可用研棒研磨，振荡器充分震荡。然后移入80ml离心管中。)
5、加入8ml/1g新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴3分钟。(时间不能太长，震荡不能太剧烈，否则基因组DNA会断裂)
6、加6ml/1g用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置10分钟,此时应形成白色絮状沉淀。
7、4℃下12000转离心30分钟。（应该重复1---2次，直到溶液澄清，过滤无杂质。这步是成功的关键）
8、加等体积异丙醇,室温静置10分钟, 4℃下12000转离心30分钟．
9、加７０％乙醇１――２ml进行漂洗．4℃下12000转离心１０分钟．
10、用尽量少的TE溶液溶解沉淀，加４微升RNA酶在５５――６５℃水浴中消化３０分钟．
11、加等体积１３％PEG8000充分混匀后静置１０分钟．在4℃下12000转离心30分钟．
12、加３mlTE溶液溶解沉淀，并移入７ml 离心管中．
13、加入等体积的饱和酚，１：１饱和酚/氯仿混合液, 氯仿，振荡混匀,进行抽提，4℃下12000g离心10分钟。
14、取上层液加等体积无水乙醇，静置１０分钟，4℃下12000g离心３０分钟。
1５、沉淀用数ml 70%乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。
16、沉淀干燥后，溶于１mlTE或水中。
17、电泳鉴定，定量．
[注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。
2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。
3. 操作应该注意枪头污染．
４. 电泳的条带和marker条带不一致，这是因为抽提的质粒不是直线状态．可能在相应bp数marker条带的前面．酶切后鉴定就会一致．
在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
（一）、碱法
1、取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液400ml，4℃下5000转离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。
2、称重一般为3-4g.
2、将细菌沉淀物重新悬浮于4ml/1g溶液I中,充分悬浮菌体细胞。(该步骤很重要，悬浮不充分直接影响到细菌的裂解效果，可用研棒研磨，振荡器充分震荡。然后移入80ml离心管中。)
5、加入8ml/1g新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴3分钟。(时间不能太长，震荡不能太剧烈，否则基因组DNA会断裂)
6、加6ml/1g用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置10分钟,此时应形成白色絮状沉淀。
7、4℃下12000转离心30分钟。（应该重复1---2次，直到溶液澄清，过滤无杂质。这步是成功的关键）
8、加等体积异丙醇,室温静置10分钟, 4℃下12000转离心30分钟．
9、加７０％乙醇１――２ml进行漂洗．4℃下12000转离心１０分钟．
10、用尽量少的TE溶液溶解沉淀，加４微升RNA酶在５５――６５℃水浴中消化３０分钟．
11、加等体积１３％PEG8000充分混匀后静置１０分钟．在4℃下12000转离心30分钟．
12、加３mlTE溶液溶解沉淀，并移入７ml 离心管中．
13、加入等体积的饱和酚，１：１饱和酚/氯仿混合液, 氯仿，振荡混匀,进行抽提，4℃下12000g离心10分钟。
14、取上层液加等体积无水乙醇，静置１０分钟，4℃下12000g离心３０分钟。
1５、沉淀用数ml 70%乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。
16、沉淀干燥后，溶于１mlTE或水中。
17、电泳鉴定，定量．
[注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。
2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。
3. 操作应该注意枪头污染．
４. 电泳的条带和marker条带不一致，这是因为抽提的质粒不是直线状态．可能在相应bp数marker条带的前面．酶切后鉴定就会一致．
