【分享】基因芯片技术综述
丁香园论坛
2145
基因芯片技术及其应用
基因芯片(DNA Chip) 又称DNA 芯片、DNA 微阵列等等,是伴随人类基因组计划而产生的,是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展。该技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化、自动化,被认为是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR 技术后的又一次革命性
的技术突破[1 ]
1 基因芯片技术简介
基因芯片将半导体工业的微型制造技术与分子生物学技术结合起来,通过把巨大数量的寡核苷酸、肽核酸或cDNA 固定在一块面积极小的硅片、玻片或尼龙膜等基片上而构成。由于该技术同时将大量的探针固定于支持物上,所以可以一次对大量序列进行检测和基因分析,解决了传统的核酸印迹杂交操作复杂、自动化程度低、检测序列数量少等缺点。基因芯片技术主要包括三个方面的内容: 芯片的制备、杂交、检测[2 ,3 ] 。
111 芯片的制备
111. 1 芯片的载体 目前适用于DNA 芯片制作的载体材料只有少数几种,象半导体硅片、玻璃片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。其中玻璃片最为常用,其原因除了来源方便、加工简单外,它还具有以下优点: ①DNA 可以共价键的形式结合在处理过的玻片上。②玻璃能耐高温和高离子强度的洗涤。③玻璃不是多孔材料,使杂交的容量保持在最小,因此能提高探针与目标分子的退火效率。④由于材料的低荧光性,不会有背景的影响。
11112 探针的固定 根据探针固定方式的不同,基因芯片可以大致分为两类:原位合成芯片( synthetic genechip) 和DNA 微集芯片(DNA microbaray) 。两类芯片的比较见表1 :
表1 原位合成芯片及DNA 微集芯片的比较
内 容 原位合成法 预合成后点样法
方式原位化学合成探针收集,显微打印
探针类型寡核苷酸cDNA、基因片段、寡核苷酸、RNA 等
最高集成度10～40 万点Pcm2 1～4 万点Pcm2
探针长度短,小于50 个碱基可较长,100～500 个碱基或更长
杂交过程条件要求高,不易控制条件要求低,较易控制
11112. 1 原位合成芯片是指直接在芯片上用4 种核苷酸合成所需探针制备而成。主要包括: ①显微光蚀刻技术:结合了半导体工业的光刻技术和DNA 合成技术。利用光保护基团修饰芯片表面碱基单体的活性羟基,通过设计特定的光刻掩膜和不断的更换曝光区域,直接在片基上合成所需探针阵列,探针数目呈指数增长。但每步合成反应的产率低,且去保护不彻底会导致杂交信号模糊。②压电打印技术:原理类似于喷墨打印机,不过喷头和墨盒有多个。墨盒中分别装上4 种碱基合成试剂,通过计算机控制将4 种碱基合成试剂打印到
包被的支持物的预定区域上,经过冲洗、封闭、氧化和脱保护等常规的化学处理步骤循环的合成。与传统的DNA 固相合成相一致,不需要特殊的化学试剂。方法对探针的设计和制备比较灵活,成本低,产率高,每步产率可达99 %。可合成出长度达40～50 个碱基的探针。③分子印章技术:我国东南大学首先提出。根据所需的微阵列设计制备有凹凸的微印章,然后根据设计在印章上涂上对应的核苷酸,按顺序将涂有不同核苷酸的微印章逐个依次压印在同一基片上,循环直至合成完毕。特点与压电打印技术相似,但可大大简化设备的投入。
1111212 DNA 微集芯片的制备是将预先合成好的探针通过点样机直接点在芯片片基上。其探针来源主要是通过常规分子生物学技术制备:如PCR(聚合酶链反应) 、RT2PCR(逆转录2聚合酶链反应) 扩增,基因克隆,人工合成等。①机械点样法:通过打印针与片基表面的接触来完成探针液滴的转移,随后自动清洗点样针进行下一轮的操作。②化学喷射法:结合了压电和其他推进方式,通过喷射器的动力将探针液滴喷射到片基表面。
112 芯片的杂交 芯片杂交过程与传统的Southern 印迹杂交等类似,属于固2液相反相杂交:探针分子固定于芯片表面,与液相的靶分子进行反应。但这种方式不仅使得检测过程平行化,可以同时检测成百上千的基因序列,而且由于集成的显微化,使得杂交所需的探针及待测样品均大为减少,杂交时间明显缩短。
113 芯片的检测分析 对于荧光标记芯片应用荧光显微镜或激光共聚焦扫描仪等采集各杂交点荧光信号如位置和强度;同位素标记多采用放射自显影检测杂交信号;最近发展的纳米金标记,通过银放大后可直接在肉眼或普通光学显微镜下观察。最终再用相关软件进行信号的分析处理,得出待测样品的核酸信息。
2 基因芯片技术的应用
基因芯片技术作为21 世纪生物技术的重要发展,在许多领域均显示出了巨大的发展潜力和应用价值。
211 医学诊断 基因芯片技术为临床疾病的诊断提供了一种全新的概念,它不仅使实验室检测的高通量、高自动化、微量化得以实现,而且使临床上对一些疑难疾病的准确诊断成为可能,从而给临床诊断工作带来革命性的进展。如在对获得性感染性疾病的诊断方面,Troesch 等[4 ] 研制了一种针对结核分支杆菌16srRNA 和aopB 基因进行检测的芯片,可以鉴定出27 种70 株不同的分支杆菌以及15 株利福平耐药株,对结核分支杆菌感染的临床诊断及流行病学调查具有重要意义。Anthony 等[5 ]利用通用引物扩增细菌23srRNA因可变区段,与含有特定寡核苷酸探针的芯片杂交,可在4h 内检测和识别出约20 种致病微生物。病毒方面,Lipshutz[6 ]利用芯片技术检测人类免疫缺陷病毒(HIV) 感染过程中其逆转录酶与蛋白酶基因的突变,结果与常规DNA 序列分析结果吻合率达98 %。Livache 等[7 ] 成功地将基因芯片技术用于血清丙型肝炎病毒(HCV) 基因分型。我国上海联合基因公司也研制出乙型肝炎病毒(HBV) 和HCV 双检基因芯片以及HBV、HCV、HIV 和结核分支杆菌(TP) 联合检测芯片,用于相关
病原体的检测和献血员的筛查。人类的许多疾病,如癌症、遗传性疾病等都与基因有关,因此利用基因芯片技术可寻找与该疾病有关的基因,实现对疾病的快速、简便、高效的诊断。
Affmetix 公司把P53 的全长序列和已知突变的探针集成在芯片上,制成基因芯片用于癌症的早期诊断。细胞色素P450 芯片用于诊断有无药物代谢缺陷。华盛顿大学分子生物学系与病理系将5 766个基因探针固定于芯片上,其中5 376个分别选自卵巢癌、卵巢表面上皮细胞、正常卵巢的cDNA 文库,另外还有342 个来自EST(表达序列标记) 克隆,包括一些已知确定的看家基因、细胞因子和因子受体基因、生长因子和受体基因、与细胞分裂相关的基因以及新近确定的肿瘤相关基因,用于卵巢癌中基因表达变化的监测[8 ] 。Lopez2Crapez 等[9 ] 应用基因芯片技术对75 例色素瘤患者的DNA 进行检测,并与直接DNA 测序法相比较,结果应用芯片法可以精确地确定所有的基因型。Drobyshev 等[10 ] 开发的寡核苷酸微集芯片用于β2地中海贫血患者红细胞中β2珠蛋白基因中三个突变位点的检测。Heller 等[11 ] 构建的96 个基因的cDNA 微集芯片用于检测风湿性关节炎(RA) 的相关基因。
212 药物研究 通过基因芯片技术可以将药物的生物效应和基因变化密切相联系,从而为药物的研究和开发注入了新的生机和活力。基因芯片技术已经参与到了现代药学研究的各个方面。如药物筛选:Kumar2Sinha[12 ] 等利用DNA 芯片筛选发现脂酸合酶(FAS) 基因及其相应的信号通路与乳腺癌的发生相关,提示该通路可能被用来作为治疗或药物筛选的新靶标。Rogers 等[13 ] 通过DNA 芯片对氟康唑耐药及敏感的白色念珠菌株的基因比较发现: 可能由于CDR1、ERG2、CRD2、GPX1、RTA3、IFD5 等基因表达上调导致了耐药的产生,而这些基因显然也就成为今后新药筛选的候选靶标分子。
Oestreicher等[14 ] 采用DNA 芯片技术对多个银屑病患者进行了全基因组范围的筛选比较,发现了其关联基因图谱,为治疗及预后提供了新的干预靶标和标志。药物毒理学及药物安全性评价:Syngenta 公司设计的称为ToxBlot Ⅱ的DNA 芯片,它包含了有关氧化应激、信号通路、应激反应等大约10 000多个毒理相关的基因。以及合理用药与个性化用药:Mikhailovich 指出可以利用DNA 芯片技术检测结核分支杆菌是否存在利福平的抗性突变,为临床用药提供指导等。甚至在中药研究中也有大量应用,为中药的研究提供一个新的平台。
213 环境监测 基因芯片可以快速大规模的检测污染源,同时帮助寻找保护基因及能够治理污染源的基因产品。如美国国立环境卫生研究院的Barrett 等构建的名为ToxChip 的DNA芯片,它可以同时检测有害化学物质对几千个不同基因表达的影响,被认为是毒理研究有力的工具。Stin 等[15 ] 设计构建了一种基于16s DNA 区间的针对致病性弧菌的检测芯片,通过对Chesapeake 港湾的水中各类弧菌的检测、鉴定,甚至定量,从而非常方便地实现对水质的变化进行监测及季节变化规律预测。因此,有环境学专家指出,基因芯片技术以及基于芯片技术构建的集样本采集、加工处理、纯化、检测为一体的微缩实验室,必将成为今后水源及相关环境检测的主要工具。
214 法律、军事医学及反恐 高科技通常被认为是一把双刃剑。但迄今为止,基因芯片还基本上被利用为一种对人类有用的工具。基因芯片可用于开发生物战病原体检测系统,研制生物战保护剂,进行血型、亲子鉴定及DNA 指纹图谱分析等,从而广泛应用于法律、军事途径,特别是在对反恐及防生物战的研究中。JP28 是一种大量用于军事途径的喷气飞机燃料,与之长期接触的地勤人员通常表现有中枢神经功能紊乱症状。Espinoza 等利用基因芯片技术研究后发现,JP28 可以影响部分基因表达,包括谷胱甘肽S2转移酶Yb2 亚基及细胞色素P450 3A1 等。进一步研究发现其还可以通过改变凋亡或应激相关基因的表达引起Jurkat 细胞的显著凋亡,为揭示JP28毒性作用机制及相应的防护研究提供了依据[16 ] 。
过去对失踪军人遗骸的识别及支离部分的鉴别、整理工作,多采用比较粗的处理方式,如目测体表特征,精确的也不过是牙齿或骨骼等一些外科特征的鉴定。但如一旦预先没有该类数据存在的话,就无从着手。最近, Gabriel 等[17 ] 就利用基因芯片技术通过对失踪军人亲属及遗骸、支离部分线粒体DNA 高变区及保守区基因的检测比对,成功的实现对遗骸识别、整理。据报道美国911 事件后,在对世贸大厦废墟中遇难者遗体的清理工作中也部分应用了基因芯片技术。
2001 年发生的引起全美恐慌的“白色粉末”事件,即炭疽袭击,给美国及世界各国的反恐提出了一个新的课题:如何快速及大面积的鉴别筛选生物袭击,尽可能的减少波及的范围及时间? 随后有研究人员在《Science》的new focus 专栏撰文认为[18 ] :在应对今后大规模的生物袭击及战场上生物战争的发生中,基因芯片应该是理想的工具,因为, ①便携性:基因芯片微量、小巧而且精确,因此可以很好的适应于各种场合及野战环境。②高通量:基因芯片可以同时快速直接地对成千上万个基因进行检测,再通过与已知病原体数据库的比对就可以快速的鉴别确定。2002 年Park 等[19 ] 在Science 杂志上介绍了一种以纳米金为探针的基于电荷检测的新型基因芯片,该芯片具有非常好的灵敏度及特异性。尤其特异性非常显著,可以在十万分之一比率中检测出单碱基突变的基因片段。在同期杂志中Service[20 ] 发表评论认为,该芯片可以极大地提升对生物武器检测的速度和能力,从而成为应对未来生物战争及生物恐吓中的有力武器!
[1 ] Shoemaker DD ,Linsley PS. Recent developments in DNA microarrays
[J ] . Curr Opin Microbiol ,2002 ,5 (3) :3342337.
[2 ] Heller MJ . DNA microarray technology : devices , systems ,and applica2
tions[J ] . Annu Rev Biomed Eng ,2002 ,4 :1292153.
[3 ] Ali TR ,Li MS ,Langford PR.Monitoring gene expression using DNA ar2
rays[J ] .Methods Mol Med ,2003 ,71 :1192134.
[4 ] Troesch A ,Nguyen H ,Miyada CG, et al .Mycobacterium species identi2
fication and rifampin resistance testing with high2density DNA probe ar2
rays[J ] . J Clin Microbiol ,1999 ,37 (1) :49255.
[5 ] Anthony RM,Brown TJ ,French GL. Rapid diagnosis of bacteremia by
universal amplification of 23s ribosomal DNA followed by hybridization
to an oligonucleotide array [ J ] . J Clin Microbiol ,2000 ,38 (2) : 7812
788.
[6 ] Lipshutz RJ ,Morris D ,Chee M, et al . Using oligonucleotide probe ar2
rays to access genetic diversity[J ] . Biotechniques ,1995 ,19 (3) :4422
447.
[7 ] Livache T ,Fouque B ,Roget A , et al . Polypyrrole DNA chip on a sili2
con device example of hapatitis C virus genotyping[J ] . Anal Biochem,
1998 ,255 (2) :1882194.
[8 ] Wang K, Gan L ,Jeffery E , et al . Monitoring gene expression profile
changes in ovarian carcinomas using cDNA microarray[J ] . Gene ,1999 ,
229(122) :1012108.
[9 ] Lopez2Crapez E ,Livache T ,Marchand J , et al . K2ras mutation detection
by hybridization to a polypyrrole DNA chip [J ] . Clin Chem,2001 ,47
(2) :1862194.
[10 ] Drobyshev A ,Mologina N ,Shik V , et al . Sequence analysis by hybrid2
ization with oligonucleotide microchip :identification of beta2thalassemia
mutations[J ] . Gene ,1997 ,188 (1) :45252.
[11 ] Heller RA ,Schena M,Chai A. Discovery and analysis of inflammatory
disease2related genes using cDNA microarrays[J ] . Proc Natl Acad Sci
USA ,1997 ,94 (6) :215022155.
[12 ] Kumar2Sinha C ,Ignatoski KW,Lippman ME , et al . Transcriptome anal2
ysis of HER2 reveals a molecular connection to fatty acid synthesis[J ] .
Cancer Res ,2003 ,63(1) :1322139.
[13 ] Rogers PD ,Barker KS. Evaluation of differential gene expression in flu2
conazole2susceptible and 2resistant isolates of Candida albicans by
cDNA microarray analysis[J ] . Antimicrob Agents Chemother ,2002 ,46
(11) :341223417.
[14 ] Oestreicher JL ,Walters IB ,Kikuchi T.Molecular classification of psori2
asis disease2associated genes through pharmacogenomic expression pro2
filing[J ] . Pharmacogenomics J ,2001 ,1(4) :2722287.
[15 ] Stin OC ,Carnahan A ,Singh R. Characterization of microbial communi2
ties from coastal waters using microarrays [J ] .
[16 ] Espinoza LA ,Smulson ME.Macroarray analysis of the effects of JP28 jet
fuel on gene expression in Jurkat cells[J ] . Toxicology ,2003 ,189 (3) :
1812190.
[17 ] Gabriel MN ,Calloway CD ,Reynolds RL , et al . Identification of human
remains by immobilized sequence2specific oligonucleotide probe analys2
is of mtDNA hypervariable regions Ⅰand Ⅱ[J ] . Croat Med J ,2003 ,
44(3) :2932298.
[18 ] Enserink M. Biodefense hampered by inadequate tests [ J ] . Science ,
2001 ,294 (5545) :126621267.
[19 ] Park SJ ,Taton TA ,Mirkin CA. Array2based electrical detection of DNA
with nanoparticle probes[J ] . Science ,2002 ,295(5559) :150321506.
[20 ] Service RF. Analytical chemistry. New test could speed bioweapon de2
tection[J ] . Science ,2002 ,295(5559) :1447.
基因芯片(DNA Chip) 又称DNA 芯片、DNA 微阵列等等,是伴随人类基因组计划而产生的,是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展。该技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化、自动化,被认为是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR 技术后的又一次革命性
的技术突破[1 ]
1 基因芯片技术简介
基因芯片将半导体工业的微型制造技术与分子生物学技术结合起来,通过把巨大数量的寡核苷酸、肽核酸或cDNA 固定在一块面积极小的硅片、玻片或尼龙膜等基片上而构成。由于该技术同时将大量的探针固定于支持物上,所以可以一次对大量序列进行检测和基因分析,解决了传统的核酸印迹杂交操作复杂、自动化程度低、检测序列数量少等缺点。基因芯片技术主要包括三个方面的内容: 芯片的制备、杂交、检测[2 ,3 ] 。
111 芯片的制备
111. 1 芯片的载体 目前适用于DNA 芯片制作的载体材料只有少数几种,象半导体硅片、玻璃片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。其中玻璃片最为常用,其原因除了来源方便、加工简单外,它还具有以下优点: ①DNA 可以共价键的形式结合在处理过的玻片上。②玻璃能耐高温和高离子强度的洗涤。③玻璃不是多孔材料,使杂交的容量保持在最小,因此能提高探针与目标分子的退火效率。④由于材料的低荧光性,不会有背景的影响。
11112 探针的固定 根据探针固定方式的不同,基因芯片可以大致分为两类:原位合成芯片( synthetic genechip) 和DNA 微集芯片(DNA microbaray) 。两类芯片的比较见表1 :
表1 原位合成芯片及DNA 微集芯片的比较
内 容 原位合成法 预合成后点样法
方式原位化学合成探针收集,显微打印
探针类型寡核苷酸cDNA、基因片段、寡核苷酸、RNA 等
最高集成度10～40 万点Pcm2 1～4 万点Pcm2
探针长度短,小于50 个碱基可较长,100～500 个碱基或更长
杂交过程条件要求高,不易控制条件要求低,较易控制
11112. 1 原位合成芯片是指直接在芯片上用4 种核苷酸合成所需探针制备而成。主要包括: ①显微光蚀刻技术:结合了半导体工业的光刻技术和DNA 合成技术。利用光保护基团修饰芯片表面碱基单体的活性羟基,通过设计特定的光刻掩膜和不断的更换曝光区域,直接在片基上合成所需探针阵列,探针数目呈指数增长。但每步合成反应的产率低,且去保护不彻底会导致杂交信号模糊。②压电打印技术:原理类似于喷墨打印机,不过喷头和墨盒有多个。墨盒中分别装上4 种碱基合成试剂,通过计算机控制将4 种碱基合成试剂打印到
包被的支持物的预定区域上,经过冲洗、封闭、氧化和脱保护等常规的化学处理步骤循环的合成。与传统的DNA 固相合成相一致,不需要特殊的化学试剂。方法对探针的设计和制备比较灵活,成本低,产率高,每步产率可达99 %。可合成出长度达40～50 个碱基的探针。③分子印章技术:我国东南大学首先提出。根据所需的微阵列设计制备有凹凸的微印章,然后根据设计在印章上涂上对应的核苷酸,按顺序将涂有不同核苷酸的微印章逐个依次压印在同一基片上,循环直至合成完毕。特点与压电打印技术相似,但可大大简化设备的投入。
1111212 DNA 微集芯片的制备是将预先合成好的探针通过点样机直接点在芯片片基上。其探针来源主要是通过常规分子生物学技术制备:如PCR(聚合酶链反应) 、RT2PCR(逆转录2聚合酶链反应) 扩增,基因克隆,人工合成等。①机械点样法:通过打印针与片基表面的接触来完成探针液滴的转移,随后自动清洗点样针进行下一轮的操作。②化学喷射法:结合了压电和其他推进方式,通过喷射器的动力将探针液滴喷射到片基表面。
112 芯片的杂交 芯片杂交过程与传统的Southern 印迹杂交等类似,属于固2液相反相杂交:探针分子固定于芯片表面,与液相的靶分子进行反应。但这种方式不仅使得检测过程平行化,可以同时检测成百上千的基因序列,而且由于集成的显微化,使得杂交所需的探针及待测样品均大为减少,杂交时间明显缩短。
113 芯片的检测分析 对于荧光标记芯片应用荧光显微镜或激光共聚焦扫描仪等采集各杂交点荧光信号如位置和强度;同位素标记多采用放射自显影检测杂交信号;最近发展的纳米金标记,通过银放大后可直接在肉眼或普通光学显微镜下观察。最终再用相关软件进行信号的分析处理,得出待测样品的核酸信息。
2 基因芯片技术的应用
基因芯片技术作为21 世纪生物技术的重要发展,在许多领域均显示出了巨大的发展潜力和应用价值。
211 医学诊断 基因芯片技术为临床疾病的诊断提供了一种全新的概念,它不仅使实验室检测的高通量、高自动化、微量化得以实现,而且使临床上对一些疑难疾病的准确诊断成为可能,从而给临床诊断工作带来革命性的进展。如在对获得性感染性疾病的诊断方面,Troesch 等[4 ] 研制了一种针对结核分支杆菌16srRNA 和aopB 基因进行检测的芯片,可以鉴定出27 种70 株不同的分支杆菌以及15 株利福平耐药株,对结核分支杆菌感染的临床诊断及流行病学调查具有重要意义。Anthony 等[5 ]利用通用引物扩增细菌23srRNA因可变区段,与含有特定寡核苷酸探针的芯片杂交,可在4h 内检测和识别出约20 种致病微生物。病毒方面,Lipshutz[6 ]利用芯片技术检测人类免疫缺陷病毒(HIV) 感染过程中其逆转录酶与蛋白酶基因的突变,结果与常规DNA 序列分析结果吻合率达98 %。Livache 等[7 ] 成功地将基因芯片技术用于血清丙型肝炎病毒(HCV) 基因分型。我国上海联合基因公司也研制出乙型肝炎病毒(HBV) 和HCV 双检基因芯片以及HBV、HCV、HIV 和结核分支杆菌(TP) 联合检测芯片,用于相关
病原体的检测和献血员的筛查。人类的许多疾病,如癌症、遗传性疾病等都与基因有关,因此利用基因芯片技术可寻找与该疾病有关的基因,实现对疾病的快速、简便、高效的诊断。
Affmetix 公司把P53 的全长序列和已知突变的探针集成在芯片上,制成基因芯片用于癌症的早期诊断。细胞色素P450 芯片用于诊断有无药物代谢缺陷。华盛顿大学分子生物学系与病理系将5 766个基因探针固定于芯片上,其中5 376个分别选自卵巢癌、卵巢表面上皮细胞、正常卵巢的cDNA 文库,另外还有342 个来自EST(表达序列标记) 克隆,包括一些已知确定的看家基因、细胞因子和因子受体基因、生长因子和受体基因、与细胞分裂相关的基因以及新近确定的肿瘤相关基因,用于卵巢癌中基因表达变化的监测[8 ] 。Lopez2Crapez 等[9 ] 应用基因芯片技术对75 例色素瘤患者的DNA 进行检测,并与直接DNA 测序法相比较,结果应用芯片法可以精确地确定所有的基因型。Drobyshev 等[10 ] 开发的寡核苷酸微集芯片用于β2地中海贫血患者红细胞中β2珠蛋白基因中三个突变位点的检测。Heller 等[11 ] 构建的96 个基因的cDNA 微集芯片用于检测风湿性关节炎(RA) 的相关基因。
212 药物研究 通过基因芯片技术可以将药物的生物效应和基因变化密切相联系,从而为药物的研究和开发注入了新的生机和活力。基因芯片技术已经参与到了现代药学研究的各个方面。如药物筛选:Kumar2Sinha[12 ] 等利用DNA 芯片筛选发现脂酸合酶(FAS) 基因及其相应的信号通路与乳腺癌的发生相关,提示该通路可能被用来作为治疗或药物筛选的新靶标。Rogers 等[13 ] 通过DNA 芯片对氟康唑耐药及敏感的白色念珠菌株的基因比较发现: 可能由于CDR1、ERG2、CRD2、GPX1、RTA3、IFD5 等基因表达上调导致了耐药的产生,而这些基因显然也就成为今后新药筛选的候选靶标分子。
Oestreicher等[14 ] 采用DNA 芯片技术对多个银屑病患者进行了全基因组范围的筛选比较,发现了其关联基因图谱,为治疗及预后提供了新的干预靶标和标志。药物毒理学及药物安全性评价:Syngenta 公司设计的称为ToxBlot Ⅱ的DNA 芯片,它包含了有关氧化应激、信号通路、应激反应等大约10 000多个毒理相关的基因。以及合理用药与个性化用药:Mikhailovich 指出可以利用DNA 芯片技术检测结核分支杆菌是否存在利福平的抗性突变,为临床用药提供指导等。甚至在中药研究中也有大量应用,为中药的研究提供一个新的平台。
213 环境监测 基因芯片可以快速大规模的检测污染源,同时帮助寻找保护基因及能够治理污染源的基因产品。如美国国立环境卫生研究院的Barrett 等构建的名为ToxChip 的DNA芯片,它可以同时检测有害化学物质对几千个不同基因表达的影响,被认为是毒理研究有力的工具。Stin 等[15 ] 设计构建了一种基于16s DNA 区间的针对致病性弧菌的检测芯片,通过对Chesapeake 港湾的水中各类弧菌的检测、鉴定,甚至定量,从而非常方便地实现对水质的变化进行监测及季节变化规律预测。因此,有环境学专家指出,基因芯片技术以及基于芯片技术构建的集样本采集、加工处理、纯化、检测为一体的微缩实验室,必将成为今后水源及相关环境检测的主要工具。
214 法律、军事医学及反恐 高科技通常被认为是一把双刃剑。但迄今为止,基因芯片还基本上被利用为一种对人类有用的工具。基因芯片可用于开发生物战病原体检测系统,研制生物战保护剂,进行血型、亲子鉴定及DNA 指纹图谱分析等,从而广泛应用于法律、军事途径,特别是在对反恐及防生物战的研究中。JP28 是一种大量用于军事途径的喷气飞机燃料,与之长期接触的地勤人员通常表现有中枢神经功能紊乱症状。Espinoza 等利用基因芯片技术研究后发现,JP28 可以影响部分基因表达,包括谷胱甘肽S2转移酶Yb2 亚基及细胞色素P450 3A1 等。进一步研究发现其还可以通过改变凋亡或应激相关基因的表达引起Jurkat 细胞的显著凋亡,为揭示JP28毒性作用机制及相应的防护研究提供了依据[16 ] 。
过去对失踪军人遗骸的识别及支离部分的鉴别、整理工作,多采用比较粗的处理方式,如目测体表特征,精确的也不过是牙齿或骨骼等一些外科特征的鉴定。但如一旦预先没有该类数据存在的话,就无从着手。最近, Gabriel 等[17 ] 就利用基因芯片技术通过对失踪军人亲属及遗骸、支离部分线粒体DNA 高变区及保守区基因的检测比对,成功的实现对遗骸识别、整理。据报道美国911 事件后,在对世贸大厦废墟中遇难者遗体的清理工作中也部分应用了基因芯片技术。
2001 年发生的引起全美恐慌的“白色粉末”事件,即炭疽袭击,给美国及世界各国的反恐提出了一个新的课题:如何快速及大面积的鉴别筛选生物袭击,尽可能的减少波及的范围及时间? 随后有研究人员在《Science》的new focus 专栏撰文认为[18 ] :在应对今后大规模的生物袭击及战场上生物战争的发生中,基因芯片应该是理想的工具,因为, ①便携性:基因芯片微量、小巧而且精确,因此可以很好的适应于各种场合及野战环境。②高通量:基因芯片可以同时快速直接地对成千上万个基因进行检测,再通过与已知病原体数据库的比对就可以快速的鉴别确定。2002 年Park 等[19 ] 在Science 杂志上介绍了一种以纳米金为探针的基于电荷检测的新型基因芯片,该芯片具有非常好的灵敏度及特异性。尤其特异性非常显著,可以在十万分之一比率中检测出单碱基突变的基因片段。在同期杂志中Service[20 ] 发表评论认为,该芯片可以极大地提升对生物武器检测的速度和能力,从而成为应对未来生物战争及生物恐吓中的有力武器!
[1 ] Shoemaker DD ,Linsley PS. Recent developments in DNA microarrays
[J ] . Curr Opin Microbiol ,2002 ,5 (3) :3342337.
[2 ] Heller MJ . DNA microarray technology : devices , systems ,and applica2
tions[J ] . Annu Rev Biomed Eng ,2002 ,4 :1292153.
[3 ] Ali TR ,Li MS ,Langford PR.Monitoring gene expression using DNA ar2
rays[J ] .Methods Mol Med ,2003 ,71 :1192134.
[4 ] Troesch A ,Nguyen H ,Miyada CG, et al .Mycobacterium species identi2
fication and rifampin resistance testing with high2density DNA probe ar2
rays[J ] . J Clin Microbiol ,1999 ,37 (1) :49255.
[5 ] Anthony RM,Brown TJ ,French GL. Rapid diagnosis of bacteremia by
universal amplification of 23s ribosomal DNA followed by hybridization
to an oligonucleotide array [ J ] . J Clin Microbiol ,2000 ,38 (2) : 7812
788.
[6 ] Lipshutz RJ ,Morris D ,Chee M, et al . Using oligonucleotide probe ar2
rays to access genetic diversity[J ] . Biotechniques ,1995 ,19 (3) :4422
447.
[7 ] Livache T ,Fouque B ,Roget A , et al . Polypyrrole DNA chip on a sili2
con device example of hapatitis C virus genotyping[J ] . Anal Biochem,
1998 ,255 (2) :1882194.
[8 ] Wang K, Gan L ,Jeffery E , et al . Monitoring gene expression profile
changes in ovarian carcinomas using cDNA microarray[J ] . Gene ,1999 ,
229(122) :1012108.
[9 ] Lopez2Crapez E ,Livache T ,Marchand J , et al . K2ras mutation detection
by hybridization to a polypyrrole DNA chip [J ] . Clin Chem,2001 ,47
(2) :1862194.
[10 ] Drobyshev A ,Mologina N ,Shik V , et al . Sequence analysis by hybrid2
ization with oligonucleotide microchip :identification of beta2thalassemia
mutations[J ] . Gene ,1997 ,188 (1) :45252.
[11 ] Heller RA ,Schena M,Chai A. Discovery and analysis of inflammatory
disease2related genes using cDNA microarrays[J ] . Proc Natl Acad Sci
USA ,1997 ,94 (6) :215022155.
[12 ] Kumar2Sinha C ,Ignatoski KW,Lippman ME , et al . Transcriptome anal2
ysis of HER2 reveals a molecular connection to fatty acid synthesis[J ] .
Cancer Res ,2003 ,63(1) :1322139.
[13 ] Rogers PD ,Barker KS. Evaluation of differential gene expression in flu2
conazole2susceptible and 2resistant isolates of Candida albicans by
cDNA microarray analysis[J ] . Antimicrob Agents Chemother ,2002 ,46
(11) :341223417.
[14 ] Oestreicher JL ,Walters IB ,Kikuchi T.Molecular classification of psori2
asis disease2associated genes through pharmacogenomic expression pro2
filing[J ] . Pharmacogenomics J ,2001 ,1(4) :2722287.
[15 ] Stin OC ,Carnahan A ,Singh R. Characterization of microbial communi2
ties from coastal waters using microarrays [J ] .
[16 ] Espinoza LA ,Smulson ME.Macroarray analysis of the effects of JP28 jet
fuel on gene expression in Jurkat cells[J ] . Toxicology ,2003 ,189 (3) :
1812190.
[17 ] Gabriel MN ,Calloway CD ,Reynolds RL , et al . Identification of human
remains by immobilized sequence2specific oligonucleotide probe analys2
is of mtDNA hypervariable regions Ⅰand Ⅱ[J ] . Croat Med J ,2003 ,
44(3) :2932298.
[18 ] Enserink M. Biodefense hampered by inadequate tests [ J ] . Science ,
2001 ,294 (5545) :126621267.
[19 ] Park SJ ,Taton TA ,Mirkin CA. Array2based electrical detection of DNA
with nanoparticle probes[J ] . Science ,2002 ,295(5559) :150321506.
[20 ] Service RF. Analytical chemistry. New test could speed bioweapon de2
tection[J ] . Science ,2002 ,295(5559) :1447.
