基因芯片技术及应用

基因芯片技术是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展，该技术是通过把巨大数量的寡核苷酸，肽核苷酸或cDNA固定在一块面积很小的硅片、玻片或尼龙膜上而构成基因芯片。

它主要是基于近年来的一种全新的DNA测序方法——杂交测序法应运而生的。由于该技术同时将大量的探针固定于支持物上，所以可以一次性对大量序列进行检测和基因分析，解决了传统的核酸印迹杂交操作复杂，操作序列数量少等缺点。基因芯片技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化和自动化。

1、技术的基本步骤

1.1 基因芯片的制备

目前基因芯片的制备主要采用三种方法：即光蚀刻合成法，压电印刷法，点样法。

1.1.1 光蚀刻合成法 是最初使用的一种方法，其主要过程是：在固相支持物上偶联带有可感光保护基团X的羟基，汞光有选择地照射到固相支持物，去掉可感光保护基团X，使羟基成为有功能的自由羟基，与加入的带X的核苷酸偶联，第一个反应物被嫁接到目标位置上。

随着反应的重复，链不断地延伸，当所需的寡核苷酸链合成完后，对反应基板进行无遮板的汞光普照，去除所有X，即可得到所多方面的寡核苷酸阵列。这样，光照模式和反应物的加入顺序决定了合成产物的序列以及在基板上的位置。

该法可以合成30个碱基左右，其优点在于精确性高，缺点是制造可感光保护剂价格较高昂贵。该法由美国的Affymetrix公司首先开发采用，目前该公司已开发成功能同时检测6500个已知人类基因的DNA芯片。

1.1.2 电压印刷法 其原理类拟于喷墨打印机，打印机头上的墨盒有四个，分别装有四种不同的碱基，打印机头在方阵上移动，并将带有某种碱基的试剂滴到基板表面，然后固定，经过洗脱和去保护后，就可连上新的核苷酸，使寡核苷酸链延伸。该法采用的技术原理与传统的DNA固相合成相一致。

压电印刷法可以合成40～50个碱基，此法效率高但工艺不太成熟，目前该法主要由美国的Incyte Pharmaceuticals公司采用。

1.1.3 点样法 即预先合成寡核苷酸，肽核苷酸或分离得到cDNA，再通过点样机直接将其点到芯片上。

寡核苷酸或肽核苷酸的合成主要是通过多孔玻璃合成法。肽核苷酸虽然在制备上比较复杂，但是它与DNA探针相比，由于PNA与DNA结合的复合物更加稳定和特异，因而更加有利于单碱基错配基因的检测。

严自某一细胞的cDNA必须进行预处理，纯化，扩增以及分类，然后再利用机械手把它们准确地固定在基板的相应位置上，为了保证cDNA芯片检测的准确性，在制备cDNA芯片以前必须提高低表达基因cDNA的丰度，降低高表达基因cDNA的丰度。

点样法的优点在于成本低、速度快，但缺点是构成方阵的寡核苷酸或cDNA片段需事先纯化。目前采用该法的公司最多，有英国的Brax Genomics Limited公司，美国的Hyseq，Molecular Dynamics，Nanogen等多家公司。

1.2 样品的制备

生物样品成分往往比较复杂，所以在与芯片接触前，必须对样品先进行处理。为了提高结果的准确性，来自血液或组织中的DNA/mRNA样本须先行扩增，然后再被荧光素或同位素标记成为探针。

1.3 杂交

影响杂交的因素很多，但主要是时间，温度及缓冲液的盐浓度。如果是表达检测，需要长历时，低温和高盐条件的较严谨性杂交。而如果是突变检测，需要短历时，高温和低盐条件高严谨性杂交。总之，杂交条件的选择要根据芯片上核酸片段的长短及其本身的用途来定。

1.4  杂交图谱的检测和读出

目前最为常用的是激光共聚焦荧光检测系统，其原理主要是与芯片发生杂交的探针上的荧光被激发后经过棱镜刚好能通过共聚集小孔，而能被探测器检测到，而芯片之外的其它荧光信号则不能被探测器检测到，检测到的荧光信号通过计算机处理后就可直接读出杂交图谱，此法灵敏度和精确度较高，但是扫描所需时间较长。另一种检测系统采用CCD摄像原理，它虽然灵敏度和精确度较低，但所需的扫描时间较短，因而更适用于临床诊断。此外，近年来还发展了多种检测方法，如质谱法，化学发光法，光导纤维法等多种方法，其中最有前途的是质谱法。

Taton等发明了一种新的芯片检测操作方案——Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probe，该法使用了Au和Ag两种金属离子来标记寡核苷酸探针，另外使用普通的平台扫描仪检测。他们通过研究发现使用金属离子标记探针与基板进行杂交时，其退火温度曲线与使用传统的荧光标记探针的完全不同。这种不同使得杂交时其单核苷酸错配的几率比传统的荧光标记探针法低3倍以上。另外这种金属离子标记探针在与芯杂交时会互相交联形成一种较大颗粒的网络结构。由于以上两个原因使用该法进行DNA芯片检测时其灵敏度比使用荧光标记法高两个数量级。

2、基因芯片技术的应用

2.1  基因芯片技术的早期应用

应用于基因测序和突变检测。DNA芯片用于测是基于杂交测序法（SBH）发展而来的，Dubiley等人在此基础上发展出邻堆杂交测序（CSH），他们把合成好的10mer寡核苷酸固定在一个0.1mm×0.1mm×0.02mm（或1mm×1mm×0.02mm）表面覆盖有聚丙烯酰铵凝胶的微片上，微片由疏水玻璃分割成200pl或20nl的微室，通过该芯片抽提单链DNA，之后与5mer的5条引物杂交，经过多步的杂交与洗脱程序后，通过计算机分析芯片上的杂交模式便可获得目的DNA的序列。该技术增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度，从而增加了测序的准确性，可对较长的DNA片段进行测序，另外也适用于对不同基因组同源区序列的比较及含有内部重复序列DNA片段的序列分析。

2.2  基因芯片技术应用于基因表达及调控的研究

生物体（组织）在不同的时间条件下有不同功能基因表达，通过从该样品中提出mRNA与含有代表该生特体（或组织）所中有功能基因的苡片进行杂交，就可该样品中功能基因的表达情况。例如，人类基因组中大约编码100000个不同的基因，通过DNA芯片技术进行检测，只需一次就几乎可以获得全部的表达情况。Lockhart等首先采用了光刻合成的20mer观核苷酸阵列对鼠B细胞和T细胞在接受药物刺激后不同时段的IL-2，IL-3，IL-4，IL-10，GM-CSF及TNF-α等一些细胞因子的表达情况进行了检测。Chambers等人也首次利用DNA芯片技术对HCMV基因表达情况进行了研究。

2.3   基因芯片技术在临床上的应用

2.3.1  致病微生物的快速诊断

Anthony等人建立了一个在4小时以内便可检测和识别出致病微生物的方法，该法的具体过程是使用随机引物通过PCR法扩增细菌核糖体²³S DNA，后通过检测系统来识别。他们运用该法对158例经血培养鉴定为阳性的样品进行检测，结果125份样品（占总量的79.7%）正确检出，而在剩下的未正确检出的样品中，有9个样品是因为基因芯片上没有相应的寡核苷酸探针，有16个样品是因为没有获得相应的PCR产物，另外8个样品，有7个样品虽然经常规方法鉴定为金黄色葡萄球菌，但是随后它们不能进一步生长，只有一个样品经分离得到金黄色葡萄球菌，而被错误的鉴定为凝固酶阴性葡萄球菌。

2.3.2  癌症的诊断及治疗

目前基因芯片技术已应用于癌相关基因突变的快速检测。Lopez-Crapez等人已运用PNA基因芯片检测肿瘤细胞中K-ras基因的突变。具体方法是以硅片为基质构建PNA芯片，样品经PCR扩增和生物素标记扩大后与芯片杂交，使用藻红蛋白作为检测标记并通过荧光显微镜检测。Lopez-Crapez等人同时运用该法和直接DNA序列分析对75个色素瘤患者的DNA样品进行检测，结果应用芯片法可精确地确定所有的基因型。Wen等人则同时运用了芯片检测技术和传统的DNA序列分析法分别对108例卵巢癌患者TP53基因的突变情况进行检测并对检验结果进行了比较和确认，结果表明芯片检测法准确率达94%，敏感性达92%，特异性为100%，而传统的DNA序列分析法准确率达87%，敏感性达82%，特异性为100%。

由于可以利用基因芯片对某一细胞的基因表达情况进行一个全面的了解，所以基因芯片技术还可进一步应用于癌症的精确认断及治疗，利用该技术可对包括白血病、淋巴瘤、皮肤黑色素瘤及乳腺癌等多种癌症的癌细胞亚群进行区分，还可利用它对治疗方案进行评估和新药药效评价，此外还能对癌症的发生、发展和转归进行预测。Lander和Golub领导的研究小组利用Affymetrix公司提供的含有6800个基因探针的基因芯片对急性粒细胞白血病（AML）和急性淋巴细胞白血病（ALL）这两种利用标准的病理诊断难以区别的癌症进行检测，发现在大多数AML和ALL细胞之间，有50个基因表达水平不一样。随后他们利用该方法对患有AML和ALL 的患者成功地进行了诊断区分。Staudt等人利用他们的淋巴芯片研究了Bcl-6癌基因的非正常活化所带来的一系列细胞内改变，研究发现Bcl-6的活化抑制了blimp-1基因（通常能启动B细胞分化为浆细胞）和p27kip1基因（抑制细胞分裂循环），而这两个基因的共同作用会导致细胞去分化及癌变。

此外，可利用基因芯片技术观察药物对肿瘤细胞基因表达谱的影响，评估药物对肿瘤治疗的可行性，从中筛选出抗肿瘤候选药物，对肿瘤药物的研究和开发提供了极具价值的参考资料。基因芯片技术在癌症基因研究及临床治疗领域的应用将不但使我们能更快速可靠地对癌症进行诊断，对其发生的内在分子机理也将有更深入的了解，同时也将癌症治疗药物的开发提供极大帮助。

另外，基因芯片技术目前已经广乏应用于新基因的识别、药物安全性评价、细胞凋亡、等位基因的多态性分析等诸多研究方面。

3、结语

基因芯片技术是一种快速、高效的核酸分析手段，它的出现给分子生物学、细胞生物学及医学领域带来了新的革命，成为后基因组时代最重要的基因功能分析技术之一。笔者认为，目前影响基因芯片技术广泛使用的主要因素是：基因芯片制备比较复杂，除了使用已经商品化的少数几种基因芯片外，科研人员要制备适合于自己科研课题的基因芯片比较困难，因而开发更为简便，成本较低，适合于科研人员操作的基因芯片制备技术是当前的迫切任务。另外，商品化的基因芯片价格昂贵，分析检测设备的成本较高也基影响了基因芯片技术的推广。故此，今后需要在降低成本方面加强研究。在基因芯片技术本身的发展方面，笔者认为进一步微型化以及提高检测的分和准确性是今后的发展方向。