E.coli genomic library construct 求教
丁香园
646
最近我在做一个E.coli genomic library construct，遇到一些问题，向论坛上的大侠请教。请帮忙看看问题出在哪里。万分感谢！
我的方法流程如下：
1。用SDS和蛋白酶K提取E.coli genomic DNA (用的是E.coli的一个突变菌株)
2。insert: Sau3AI digest E.coli genomic DNA, partail digestion, to get 2kb-5kb, 这一步我摸过酶切时间梯度，用0.1unit Sau3AI，40ul 反应体系，约3ug genomic DNA， 部分酶切可得到约1ug的smear片断。
3. vector: pBR322 BamHI digestion （注：我的genomic DNA 和 Vector pBR322 都是手提的，没用试剂盒，从酶切效果来看，还可以。） 1％gel切胶回收用的 是鼎国的kit。
4. ligation: T4 ligase（Takara company）, insert:vector (mol)=3:1 （总DNA约0.5ug）
5. ethanol 沉淀，electrotransformation, 结果得到的colony比较少，0.5ug 连接产物沉淀后, dissolve in 20ul ddH2O, 2ul + 50ul cell, spread on 8 plates, 总共只得到约1000个colonies（由于vector是单酶切，这里面还有载体自连产物，电转感受态细胞的转化效率很高，10的7次方－10的8次方），我的目的是希望尽可能cover E.coli 2kb-5kb之间的gene，所以希望能够得到5000－1w左右的colony。 但似乎电转达不到这个目的。
我的老板给的建议是把insert用BamHI Meghylase甲基化处理，然后在T4连接过程中在连接体系中同时加入0.5unit BamHI, 18度 20min -> 20度 20min， 20 cycles，然后65度 15min酶失活处理，乙醇沉淀，电转。这个方案我正在试，还没 得到结果。还想请问对载体磷酸化是不是很必要？
我已经反复做了一个多月了，没有突破，很是着急， 从论坛上也看到相关的帖子，如果有什么好的实验方法资料推荐，请一定多多指点。万分感谢！
我的方法流程如下：
1。用SDS和蛋白酶K提取E.coli genomic DNA (用的是E.coli的一个突变菌株)
2。insert: Sau3AI digest E.coli genomic DNA, partail digestion, to get 2kb-5kb, 这一步我摸过酶切时间梯度，用0.1unit Sau3AI，40ul 反应体系，约3ug genomic DNA， 部分酶切可得到约1ug的smear片断。
3. vector: pBR322 BamHI digestion （注：我的genomic DNA 和 Vector pBR322 都是手提的，没用试剂盒，从酶切效果来看，还可以。） 1％gel切胶回收用的 是鼎国的kit。
4. ligation: T4 ligase（Takara company）, insert:vector (mol)=3:1 （总DNA约0.5ug）
5. ethanol 沉淀，electrotransformation, 结果得到的colony比较少，0.5ug 连接产物沉淀后, dissolve in 20ul ddH2O, 2ul + 50ul cell, spread on 8 plates, 总共只得到约1000个colonies（由于vector是单酶切，这里面还有载体自连产物，电转感受态细胞的转化效率很高，10的7次方－10的8次方），我的目的是希望尽可能cover E.coli 2kb-5kb之间的gene，所以希望能够得到5000－1w左右的colony。 但似乎电转达不到这个目的。
我的老板给的建议是把insert用BamHI Meghylase甲基化处理，然后在T4连接过程中在连接体系中同时加入0.5unit BamHI, 18度 20min -> 20度 20min， 20 cycles，然后65度 15min酶失活处理，乙醇沉淀，电转。这个方案我正在试，还没 得到结果。还想请问对载体磷酸化是不是很必要？
我已经反复做了一个多月了，没有突破，很是着急， 从论坛上也看到相关的帖子，如果有什么好的实验方法资料推荐，请一定多多指点。万分感谢！
