【共享】dsDNA微阵列的原理

dsDNA 微阵列又叫蛋白质结合微阵列(Protein binding microarray, PBM), 由Bulyk等[7]在1999 年首次提出。它的基本原理是在玻片上很小的面积内(约1 cm2)固定成千上万的dsDNA分子作为探针, 检测与大量DNA分子与DNA结合蛋白之间的相互作用。这种检测在原理上模拟的是DNA结合转录因子在体内与其DNA结合位点的相互作用。在基因组DNA中, 转录因子的DNA结合位点一般是一段很短(约5~20 bp)的序列, 如转录因子HIF-1的结合位点为5 bp、E2F的结合位点为8 bp, NF-κB的结合位点为10 bp, p53的结合位点为20 bp; 同一家族的转录因子其DNA结合位点在序列和长度上都比较保守, 因此一般能用共同基序(Consensus)或模体(Motif)反映转录因子的DNA结合位点。DNA结合转录因子都含有DNA结合结构域(DNA-binding domain, DBD), 该结构域负责转录因子与DNA位点的识别和结合。同一家族的转录因子一般拥有结构非常相似的DBD, 并且在与DNA结合时, 一般以同二聚体或异二聚体的形式与DNA位点结合, 因此转录因子的结合位点一般呈现近似的或完全的回文结构。该回文结构分为两个半位点, 每个二聚体亚基结合一个半位点。转录因子与其DNA位点的结合主要依靠关键碱基和重要氨基酸之间的形成的氢键, 这是转录因子DNA序列特异性的分子基础; 其次还有范德华力、盐键等, 主要影响转录因子与DNA结合的亲和性。转录因子与其DNA位点的结合不仅在体内环境中可以发生, 而且在体外环境中也可以发生, 因此, 才有电泳迁移率变动分析(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)等转录因子DNA结合活性检测技术。在EMSA检测中, 转录因子蛋白是与游离的DNA探针分子(含有待检转录因子的DNA结合位点)相互作用(结合), 而在dsDNA 微阵列芯片上, 转录因子蛋白是与固定在固相表面的DNA探针分子相互作用(结合)。一个典型的dsDNA微阵列实验包括下列程序(图1)：首先设计并制备高密度dsDNA微阵列, 之后用表位标签融合的转录因子蛋白与dsDNA微阵列进行结合反应, 经洗涤去除非特异性结合后, 用荧光标记的标签抗体与微阵列结合, 再经过荧光扫描获取荧光信号, 以荧光信号的强弱报告转录因子蛋白与各种DNA序列的结合信息。最后经数据归一化处理及分析, 表征转录因子的DNA结合特异性及亲和性[8,9]
图1 dsDNA微阵列实验流程
图中示意了dsDNA微阵列制备及检测转录因子蛋白的原理, 包括(1)常用的dsDNA微阵列制备方法：使用通用引物延伸法将经点样或原位合成制备的单链DNA(ssDNA)微阵列转换为dsDNA微阵列; (2)两种常用的dsDNA微阵列DNA标记技术：荧光标记核苷酸掺入法(A)和荧光标记核苷酸末端转移标记法(B); (3)转录因子蛋白与DNA互作的检测：使用标签融合转录因子蛋白与dsDNA微阵列反应, 再使用荧光标记抗标签抗体报告结合信息的转录因子蛋白DNA结合; (4)dsDNA微阵列荧光扫描及数据分析。DNA探针上的粗线部分表示待检测的与DNA结合蛋白互作的序列, 如随机k-mer序列