【求助】cAMP的测定
丁香园论坛
17965
大侠们，我现在用的是promega公司的cAMP测定试剂盒，按照说明书上面要求做的标准曲线，可是我做了几次出来和说明书上面都不一样，是怎么回事？求解！！！
现在有测cAMP的同志们一起讨论下，我的Q:1186130200
现在有测cAMP的同志们一起讨论下，我的Q:1186130200
我们用的是PE的盒子
LANCETM cAMP 384Kit（PE公司）
1.检测原理：
该试剂盒是一种时间分辨的荧光共振能量转移免疫分析，该反应是一个竞争免疫反应，即铕标的cAMP示踪复合物与体系中的cAMP竞争结合标有Alexa Fluor 647染料的cAMP抗体。铕标cAMP示踪复合物是通过Biotin标记的cAMP与铕标的抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）与抗体的复合物紧密结合产生的。
当抗体结合到示踪剂上时，340nm的激发光激发铕标分子，导致能量转移到Alexa Fluor 647染料上，结果产生665nm的发射光。荧光的强度与样品中的cAMP含量成反比。
本试剂盒用于检测在GPCR激动剂刺激下活细胞或者细胞膜制备品产生的cAMP。对于偶联Gαs的受体，激动剂刺激导致665nm的荧光强度降低，而拮抗剂则可以逆转这一效应；对于偶联Gαi的受体，在激动剂刺激的同时用forskolin刺激cAMP产生，那么激动剂则抑制forskolin诱导的cAMP的生成，因此对照只给forskolin的细胞组可以通过665nm荧光强度的增加反应激动剂的效应。
该试剂盒的灵敏度很高，室温下反应在20h内是稳定的。本试剂盒适用于在384孔板中进行24μl的微量分析。
2.保存条件
避光2~4℃保存，过期时间见外包装。
3.盒内试剂
cAMP标准品：1管，1ml。（50μM）
生物素标记的cAMP（b-cAMP）：1管，25μl。
铕标的抗生物素蛋白链菌素：1管，25μl。
荧光标记的cAMP抗体：1管，40μl。
检测缓冲液：1瓶，25ml。
4.需要自配的其他溶液
l Hank’s balanced salt solution (HBSS): NaCl 8.0g、CaCl2 0.14g、KCl 0.4g、 KH2PO4 0.06g、Na2HPO4?7H2O0.09g、MgCl2.6H2O0.10 g、MgSO4.7H2O0.10 g、NaHCO30.35g、葡萄糖1.0g，加H2O至 1000ml (用7.5%NaHCO调节PH值=7.4)
l Versene消化液（1L）：EDTA 0.372 g，NaCl 8.0g，KCl 0.20 g，KH2PO40.20g，Na2HPO4 1.15 g，D-glucouse 0.2 g，pH 7.4
l HEPES缓冲液(1mol/L)：取2.383gHEPES溶于10ml去离子水中。
l 7.5%BSA溶液：取0.75gBSA溶于10ml去离子水中
l 0.5M IBMX溶液：11.11mg IBMX溶于100μl DMSO中，-20℃冻存。
l 刺激缓冲液（SB）：14 ml HBSS(1×)+75μlHEPES(1mol/L)+200μlBSA (7.5%)。(注：在测定细胞cAMP时，反应缓冲液中要加入IBMX 0.5mmol/L)
l 吗啡贮存液(10mM)：盐酸吗啡37.585mg溶于10ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
l 纳络酮母液(100mM)：纳络酮4mg溶于100μl 生理盐水中，用时工作液按照1:500稀释，溶剂为含有IBMX的反应缓冲液。
仪器设置问题
5.操作规程
①用刺激缓冲液稀释cAMP系列浓度
②配制Alexa fluor标记的cAMP抗体工作液
将Alexa fluor标记的cAMP抗体原液稀释100倍，溶剂为刺激缓冲液，混匀抗体工作液要柔和，上下颠倒即可，拒绝震荡；
③配制检测复合物
a :取5μl EU-SA加到85μl检测缓冲液中 (a液)
b :取5μl b-cAMP加到25μl检测缓冲液中(b液)
c :取5μl a液加到615μl检测缓冲液中，再加入5μl b液，轻轻混匀，室温至少孵育15min，形成检测复合物，顺序很重要，别错了，先稀释EU，后加b-cAMP。
④标准品测定(在白色384孔板中反应，每个样品均为复孔，反应体积24μl)；
l 加入6μlcAMP标准品（刺激缓冲液配制）；
l 加入6μlAlexafluor标记的cAMP抗体工作液（刺激缓冲液配制）；
l 37℃避光反应30-60分钟；
l 加入12μl检测复合物（检测缓冲液配制）；
l 37℃避光反应60分钟（盖盖或封膜）；
l 时间分辨荧光测定(样品测定可以在孵育1h后测定荧光，但不绝对，在1-20h后测定不会显著降低测定灵敏性)。为了保证重现性，测定荧光的时间必须确定。
l 绘制cAMP标准曲线图：以标准cAMP浓度的对数为横坐标，以测定的665nM发射光(D665nM)为纵坐标，绘制标准曲线图。经graphpad中非线性回归（进行曲线拟和，即可得到cAMP浓度和发射光D665nM之间的换算公式。
⑤样品cAMP含量测定
l 准备工作
在测定cAMP样品之前，几个重点因素需要考察：
一是每孔细胞数量，二是forskolin刺激的浓度，三是激动剂的浓度。
首先要做在不同细胞数量（1000~12000/well）下,forskolin的剂量效应关系，选择线性范围与cAMP标准曲线线性范围最吻合或贴近的细胞数量；
其次拟合出forskolin的EC50或EC80（对于弱效的激动剂，可能选择EC50更加敏感些，但选择EC80则提供的检测窗口更大些），确定forskolin的用量；
最后，做两条激动剂依赖的量效关系，一条是在有拮抗剂（参考最大量）的情况下，另一条是在没有拮抗剂的情况下，两条曲线作于一张图上，选择差别最大的那个浓度点，一般是EC80。
LANCETM cAMP 384Kit（PE公司）
1.检测原理：
该试剂盒是一种时间分辨的荧光共振能量转移免疫分析，该反应是一个竞争免疫反应，即铕标的cAMP示踪复合物与体系中的cAMP竞争结合标有Alexa Fluor 647染料的cAMP抗体。铕标cAMP示踪复合物是通过Biotin标记的cAMP与铕标的抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）与抗体的复合物紧密结合产生的。
当抗体结合到示踪剂上时，340nm的激发光激发铕标分子，导致能量转移到Alexa Fluor 647染料上，结果产生665nm的发射光。荧光的强度与样品中的cAMP含量成反比。
本试剂盒用于检测在GPCR激动剂刺激下活细胞或者细胞膜制备品产生的cAMP。对于偶联Gαs的受体，激动剂刺激导致665nm的荧光强度降低，而拮抗剂则可以逆转这一效应；对于偶联Gαi的受体，在激动剂刺激的同时用forskolin刺激cAMP产生，那么激动剂则抑制forskolin诱导的cAMP的生成，因此对照只给forskolin的细胞组可以通过665nm荧光强度的增加反应激动剂的效应。
该试剂盒的灵敏度很高，室温下反应在20h内是稳定的。本试剂盒适用于在384孔板中进行24μl的微量分析。
2.保存条件
避光2~4℃保存，过期时间见外包装。
3.盒内试剂
cAMP标准品：1管，1ml。（50μM）
生物素标记的cAMP（b-cAMP）：1管，25μl。
铕标的抗生物素蛋白链菌素：1管，25μl。
荧光标记的cAMP抗体：1管，40μl。
检测缓冲液：1瓶，25ml。
4.需要自配的其他溶液
l Hank’s balanced salt solution (HBSS): NaCl 8.0g、CaCl2 0.14g、KCl 0.4g、 KH2PO4 0.06g、Na2HPO4?7H2O0.09g、MgCl2.6H2O0.10 g、MgSO4.7H2O0.10 g、NaHCO30.35g、葡萄糖1.0g，加H2O至 1000ml (用7.5%NaHCO调节PH值=7.4)
l Versene消化液（1L）：EDTA 0.372 g，NaCl 8.0g，KCl 0.20 g，KH2PO40.20g，Na2HPO4 1.15 g，D-glucouse 0.2 g，pH 7.4
l HEPES缓冲液(1mol/L)：取2.383gHEPES溶于10ml去离子水中。
l 7.5%BSA溶液：取0.75gBSA溶于10ml去离子水中
l 0.5M IBMX溶液：11.11mg IBMX溶于100μl DMSO中，-20℃冻存。
l 刺激缓冲液（SB）：14 ml HBSS(1×)+75μlHEPES(1mol/L)+200μlBSA (7.5%)。(注：在测定细胞cAMP时，反应缓冲液中要加入IBMX 0.5mmol/L)
l 吗啡贮存液(10mM)：盐酸吗啡37.585mg溶于10ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
l 纳络酮母液(100mM)：纳络酮4mg溶于100μl 生理盐水中，用时工作液按照1:500稀释，溶剂为含有IBMX的反应缓冲液。
仪器设置问题
5.操作规程
①用刺激缓冲液稀释cAMP系列浓度
| <center> Dilution</center> | <center> Final concentration(M)</center> | <center> Intermediate</center> <center> (M)</center> | <center> Volume of dilution</center> | <center> Stimulation buffer</center> |
| <center> 1</center> | <center> 1×10<sup>-6</sup></center> | <center> 4×10<sup>-6</sup></center> | <center> 8μl of 50μM</center> | <center> 92μl</center> |
| <center> 2</center> | <center> 3×10<sup>-7</sup></center> | <center> 1.2×10<sup>-6</sup></center> | <center> 30μl of dil 1</center> | <center> 70μl</center> |
| <center> 3</center> | <center> 1×10<sup>-7</sup></center> | <center> 4×10<sup>-7</sup></center> | <center> 30μl of dil 2</center> | <center> 60μl</center> |
| <center> 4</center> | <center> 3×10<sup>-8</sup></center> | <center> 1.2×10<sup>-7</sup></center> | <center> 30μl of dil 3</center> | <center> 70μl</center> |
| <center> 5</center> | <center> 1×10<sup>-8</sup></center> | <center> 4×10<sup>-8</sup></center> | <center> 30μl of dil4</center> | <center> 60μl</center> |
| <center> 6</center> | <center> 3×10<sup>-9</sup></center> | <center> 1.2×10<sup>-8</sup></center> | <center> 30μl of dil 5</center> | <center> 70μl</center> |
| <center> 7</center> | <center> 1×10<sup>-9</sup></center> | <center> 4×10<sup>-9</sup></center> | <center> 30μl of dil 6</center> | <center> 60μl</center> |
| <center> 8</center> | <center> 3×10<sup>-10</sup></center> | <center> 1.2×10<sup>-9</sup></center> | <center> 30μl of dil 7</center> | <center> 70μl</center> |
| <center> 9</center> | <center> 1×10<sup>-10</sup></center> | <center> 4×10<sup>-10</sup></center> | <center> 30μl of dil 8</center> | <center> 60μl</center> |
| <center> 10</center> | <center> 3×10<sup>-11</sup></center> | <center> 1.2×10<sup>-10</sup></center> | <center> 30μl of dil 9</center> | <center> 70μl</center> |
| <center> 11</center> | <center> 1×10<sup>-11</sup></center> | <center> 4×10<sup>-11</sup></center> | <center> 30μl of dil 10</center> | <center> 60μl</center> |
| <center> 12</center> | <center> -</center> | <center> -</center> | <center> -</center> | <center> 70μl</center> |
②配制Alexa fluor标记的cAMP抗体工作液
将Alexa fluor标记的cAMP抗体原液稀释100倍，溶剂为刺激缓冲液，混匀抗体工作液要柔和，上下颠倒即可，拒绝震荡；
③配制检测复合物
a :取5μl EU-SA加到85μl检测缓冲液中 (a液)
b :取5μl b-cAMP加到25μl检测缓冲液中(b液)
c :取5μl a液加到615μl检测缓冲液中，再加入5μl b液，轻轻混匀，室温至少孵育15min，形成检测复合物，顺序很重要，别错了，先稀释EU，后加b-cAMP。
④标准品测定(在白色384孔板中反应，每个样品均为复孔，反应体积24μl)；
l 加入6μlcAMP标准品（刺激缓冲液配制）；
l 加入6μlAlexafluor标记的cAMP抗体工作液（刺激缓冲液配制）；
l 37℃避光反应30-60分钟；
l 加入12μl检测复合物（检测缓冲液配制）；
l 37℃避光反应60分钟（盖盖或封膜）；
l 时间分辨荧光测定(样品测定可以在孵育1h后测定荧光，但不绝对，在1-20h后测定不会显著降低测定灵敏性)。为了保证重现性，测定荧光的时间必须确定。
l 绘制cAMP标准曲线图：以标准cAMP浓度的对数为横坐标，以测定的665nM发射光(D665nM)为纵坐标，绘制标准曲线图。经graphpad中非线性回归（进行曲线拟和，即可得到cAMP浓度和发射光D665nM之间的换算公式。
⑤样品cAMP含量测定
l 准备工作
在测定cAMP样品之前，几个重点因素需要考察：
一是每孔细胞数量，二是forskolin刺激的浓度，三是激动剂的浓度。
首先要做在不同细胞数量（1000~12000/well）下,forskolin的剂量效应关系，选择线性范围与cAMP标准曲线线性范围最吻合或贴近的细胞数量；
其次拟合出forskolin的EC50或EC80（对于弱效的激动剂，可能选择EC50更加敏感些，但选择EC80则提供的检测窗口更大些），确定forskolin的用量；
最后，做两条激动剂依赖的量效关系，一条是在有拮抗剂（参考最大量）的情况下，另一条是在没有拮抗剂的情况下，两条曲线作于一张图上，选择差别最大的那个浓度点，一般是EC80。
楼主你最后用的是哪个公司的camp试剂盒呢？我最近也要做~不知道哪个比较好
牙刷小妮 wrote:
楼主你最后用的是哪个公司的camp试剂盒呢？我最近也要做~不知道哪个比较好
同问，您用的是哪家的呢
bianbenjamin wrote:
我们用的是PE的盒子
LANCETM cAMP 384Kit（PE公司）
1.检测原理：
该试剂盒是一种时间分辨的荧光共振能量转移免疫分析，该反应是一个竞争免疫反应，即铕标的cAMP示踪复合物与体系中的cAMP竞争结合标有Alexa Fluor 647染料的cAMP抗体。铕标cAMP示踪复合物是通过Biotin标记的cAMP与铕标的抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）与抗体的复合物紧密结合产生的。
当抗体结合到示踪剂上时，340nm的激发光激发铕标分子，导致能量转移到Alexa Fluor 647染料上，结果产生665nm的发射光。荧光的强度与样品中的cAMP含量成反比。
本试剂盒用于检测在GPCR激动剂刺激下活细胞或者细胞膜制备品产生的cAMP。对于偶联Gαs的受体，激动剂刺激导致665nm的荧光强度降低，而拮抗剂则可以逆转这一效应；对于偶联Gαi的受体，在激动剂刺激的同时用forskolin刺激cAMP产生，那么激动剂则抑制forskolin诱导的cAMP的生成，因此对照只给forskolin的细胞组可以通过665nm荧光强度的增加反应激动剂的效应。
该试剂盒的灵敏度很高，室温下反应在20h内是稳定的。本试剂盒适用于在384孔板中进行24μl的微量分析。
2.保存条件
避光2~4℃保存，过期时间见外包装。
3.盒内试剂
cAMP标准品：1管，1ml。（50μM）
生物素标记的cAMP（b-cAMP）：1管，25μl。
铕标的抗生物素蛋白链菌素：1管，25μl。
荧光标记的cAMP抗体：1管，40μl。
检测缓冲液：1瓶，25ml。
4.需要自配的其他溶液
l Hank’s balanced salt solution (HBSS): NaCl 8.0g、CaCl2 0.14g、KCl 0.4g、 KH2PO4 0.06g、Na2HPO4?7H2O0.09g、MgCl2.6H2O0.10 g、MgSO4.7H2O0.10 g、NaHCO30.35g、葡萄糖1.0g，加H2O至 1000ml (用7.5%NaHCO调节PH值=7.4)
l Versene消化液（1L）：EDTA 0.372 g，NaCl 8.0g，KCl 0.20 g，KH2PO40.20g，Na2HPO4 1.15 g，D-glucouse 0.2 g，pH 7.4
l HEPES缓冲液(1mol/L)：取2.383gHEPES溶于10ml去离子水中。
l 7.5%BSA溶液：取0.75gBSA溶于10ml去离子水中
l 0.5M IBMX溶液：11.11mg IBMX溶于100μl DMSO中，-20℃冻存。
l 刺激缓冲液（SB）：14 ml HBSS(1×)+75μlHEPES(1mol/L)+200μlBSA (7.5%)。(注：在测定细胞cAMP时，反应缓冲液中要加入IBMX 0.5mmol/L)
l 吗啡贮存液(10mM)：盐酸吗啡37.585mg溶于10ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
l 纳络酮母液(100mM)：纳络酮4mg溶于100μl 生理盐水中，用时工作液按照1:500稀释，溶剂为含有IBMX的反应缓冲液。
仪器设置问题
5.操作规程
①用刺激缓冲液稀释cAMP系列浓度
<center> Dilution</center> <center> Final concentration(M)</center> <center> Intermediate</center> <center> (M)</center> <center> Volume of dilution</center> <center> Stimulation buffer</center> <center> 1</center> <center> 1×10<sup>-6</sup></center> <center> 4×10<sup>-6</sup></center> <center> 8μl of 50μM</center> <center> 92μl</center> <center> 2</center> <center> 3×10<sup>-7</sup></center> <center> 1.2×10<sup>-6</sup></center> <center> 30μl of dil 1</center> <center> 70μl</center> <center> 3</center> <center> 1×10<sup>-7</sup></center> <center> 4×10<sup>-7</sup></center> <center> 30μl of dil 2</center> <center> 60μl</center> <center> 4</center> <center> 3×10<sup>-8</sup></center> <center> 1.2×10<sup>-7</sup></center> <center> 30μl of dil 3</center> <center> 70μl</center> <center> 5</center> <center> 1×10<sup>-8</sup></center> <center> 4×10<sup>-8</sup></center> <center> 30μl of dil4</center> <center> 60μl</center> <center> 6</center> <center> 3×10<sup>-9</sup></center> <center> 1.2×10<sup>-8</sup></center> <center> 30μl of dil 5</center> <center> 70μl</center> <center> 7</center> <center> 1×10<sup>-9</sup></center> <center> 4×10<sup>-9</sup></center> <center> 30μl of dil 6</center> <center> 60μl</center> <center> 8</center> <center> 3×10<sup>-10</sup></center> <center> 1.2×10<sup>-9</sup></center> <center> 30μl of dil 7</center> <center> 70μl</center> <center> 9</center> <center> 1×10<sup>-10</sup></center> <center> 4×10<sup>-10</sup></center> <center> 30μl of dil 8</center> <center> 60μl</center> <center> 10</center> <center> 3×10<sup>-11</sup></center> <center> 1.2×10<sup>-10</sup></center> <center> 30μl of dil 9</center> <center> 70μl</center> <center> 11</center> <center> 1×10<sup>-11</sup></center> <center> 4×10<sup>-11</sup></center> <center> 30μl of dil 10</center> <center> 60μl</center> <center> 12</center> <center> -</center> <center> -</center> <center> -</center> <center> 70μl</center>
②配制Alexa fluor标记的cAMP抗体工作液
将Alexa fluor标记的cAMP抗体原液稀释100倍，溶剂为刺激缓冲液，混匀抗体工作液要柔和，上下颠倒即可，拒绝震荡；
③配制检测复合物
a :取5μl EU-SA加到85μl检测缓冲液中 (a液)
b :取5μl b-cAMP加到25μl检测缓冲液中(b液)
c :取5μl a液加到615μl检测缓冲液中，再加入5μl b液，轻轻混匀，室温至少孵育15min，形成检测复合物，顺序很重要，别错了，先稀释EU，后加b-cAMP。
④标准品测定(在白色384孔板中反应，每个样品均为复孔，反应体积24μl)；
l 加入6μlcAMP标准品（刺激缓冲液配制）；
l 加入6μlAlexafluor标记的cAMP抗体工作液（刺激缓冲液配制）；
l 37℃避光反应30-60分钟；
l 加入12μl检测复合物（检测缓冲液配制）；
l 37℃避光反应60分钟（盖盖或封膜）；
l 时间分辨荧光测定(样品测定可以在孵育1h后测定荧光，但不绝对，在1-20h后测定不会显著降低测定灵敏性)。为了保证重现性，测定荧光的时间必须确定。
l 绘制cAMP标准曲线图：以标准cAMP浓度的对数为横坐标，以测定的665nM发射光(D665nM)为纵坐标，绘制标准曲线图。经graphpad中非线性回归（进行曲线拟和，即可得到cAMP浓度和发射光D665nM之间的换算公式。
⑤样品cAMP含量测定
l 准备工作
在测定cAMP样品之前，几个重点因素需要考察：
一是每孔细胞数量，二是forskolin刺激的浓度，三是激动剂的浓度。
首先要做在不同细胞数量（1000~12000/well）下,forskolin的剂量效应关系，选择线性范围与cAMP标准曲线线性范围最吻合或贴近的细胞数量；
其次拟合出forskolin的EC50或EC80（对于弱效的激动剂，可能选择EC50更加敏感些，但选择EC80则提供的检测窗口更大些），确定forskolin的用量；
最后，做两条激动剂依赖的量效关系，一条是在有拮抗剂（参考最大量）的情况下，另一条是在没有拮抗剂的情况下，两条曲线作于一张图上，选择差别最大的那个浓度点，一般是EC80。
看起来好复杂，请教一下，这种方法能不能用来检测脑组织cAMP的含量呢？
同问，我最近用R&D的试剂盒测，做三次，两次标准曲线很好，但样品的cAMP浓度不稳定
我也是用的R ＆D公司 为什么我的每次都检测不到啊，我试过超声波和细胞裂解液（同时加了PDE抑制剂）处理细胞 然后离心取上清。能请教下你是怎么做的么？
建议用NewEast Biosciences公司的基于单克隆抗体的cAMP 竞争ELISA检测试剂盒，无需对样品中的cAMP进行乙酰化。
http://www.neweastbio.com/NonAcetylatedCamp.do
http://www.neweastbio.com/NonAcetylatedCamp.do
http://www.mediomics.com/camp_desinger.html
我准备试试这个
<center>
<strong>如何定量检测cAMP和cGMP</strong></center>
背景介绍
1958年Sutherland发现了cAMP(环磷酸腺苷)，并因此获得了1971年诺贝尔生理与医学奖[1].1963年Ashman发现了cGMP（环磷酸鸟苷）[2]。50年过去了，人们已明白cAMP、cGMP是在很多生理过程中发挥重要调节作用的第二信使分子。鸟苷酸环化酶可将GTP催化生成cGMP，cGMP可以被磷酸二酯酶水解成GDP。激活鸟苷酸环化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加细胞内cGMP的含量。cGMP特异性磷酸二酯酶的抑制剂被用来治疗人类的某些疾病，比如cGMP特异性磷酸二酯酶类型5的抑制剂（伟哥和**）被用来治疗ED（勃起功能障碍）；腺苷酸环化酶将ATP催化生成cAMP，cAMP可以被磷酸二酯酶水解成ADP。激活腺苷酸环化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加细胞内cAMP的含量。腺苷酸环化酶激活受体的阻断剂和cAMP特异性磷酸二酯酶的抑制剂被用来治疗人类的某些疾病，比如针对升高cAMP水平的b-肾上腺素受体的阻断剂被用于治疗心律失常、高血压、心肌梗塞和心力衰竭等疾病。
在五十年的研究历程中，从开始研究cAMP，cGMP在各种生理过程中的调节作用，到近几年与之相关的药物研发，药物筛选领域，人们一直在努力寻找一种快速、灵敏、特异性和可重复地定量检测cAMP和cGMP含量的方法。
检测方法演变
cAMP，cGMP分子量分别只有329.21和345.21，在机体内的含量极低，为p mol/L级别，用一般的分析方法无法测定。70年代一系列测定cAMP和cGMP的方法被发明出来，最基本的原理有三种：分别是竞争性蛋白质结合分析法[3]、放射性免疫分析法[4]和薄层色谱法[5]。在80年代，放射性免疫分析法得到了广泛的应用和改进，由于这种方法采用放射性核素标记，应用范围受到一定限制，为了进一步提高检测的灵敏度和操作的安全性，进入90年代又陆续发明了各种酶标记法和化学发光法的竞争性ELISA检测试剂盒，这一类检测方法的根本原理都是基于抗体抗原的免疫反应，所有这些试剂盒中采用的抗体全部是兔抗血清或者是经过特异亲和提纯之后的抗cAMP或cGMP的兔多抗，毫无疑问，兔多抗在约四十年的cAMP，cGMP定量检测中做出了巨大贡献，但同时它也有着明显的缺陷：
1，兔多抗对cAMP，cGMP的特异性不高，会与其他核苷类似分子发生交叉反应，尽管可以通过特异亲和提纯降低交叉，但仍然无法消除交叉；
2，兔多抗对cAMP和cGMP的亲和力受高浓度的二价阳离子（比如Mg2+和Ca2+）的影响；
3，兔多抗在制备的过程中存在个体差异和批间差异，难以保证检测数据的重复性；
4，兔多抗试剂盒在cAMP，cGMP样品的处理上也需要进行乙酰化处理，这与兔多克隆抗体制备方法有必然关系，如果不乙酰化将无法达到检测所需的灵敏度。
所以无论标记方法如何革新，不改进抗体，仍然不能从根本上迎来cAMP，cGMP定量检测的变革。
cAMP和cGMP单克隆抗体成功开发
NewEast Biosciences（纽斯特）公司的科学家经过两年的研发，筛选了4万多个克隆，终于从中发现了高特异性，高亲和力的cAMP和cGMP单克隆抗体。并成功构建了世界上唯一的基于单抗的cAMP和cGMP ELISA检测试剂盒。这个cAMP（cGMP）单抗对非乙酰化的cAMP（cGMP）的特异性识别能力是其对cGMP（cAMP）、ATP（GTP）以及其他核苷类似物识别能力的108倍以上，这相比于以往的多抗试剂盒大大提高了cAMP (cGMP) 检测的灵敏性和特异性，并且极大的降低了试剂盒的批间差异，提供了长久有效地可重复性检测，也彻底摆脱了繁琐的乙酰化过程和对科研人员健康不利的乙酰化挥发试剂。
该试剂盒一经推出，得到了学术界的广泛认可，几年来陆续发表论文十多篇。
已发表论文：
1. Castro, L. R., J. Schittl, et al. (2010). "Feedback control through cGMP-dependent protein kinase contributes to differential regulation and compartmentation of cGMP in rat cardiac myocytes." Circ Res 107(10): 1232-1240.
2. Guo, D., J. J. Zhang, et al. (2009). "Stimulation of guanylyl cyclase-D by bicarbonate." Biochemistry 48(20): 4417-4422.
3. Long, Y., Q. Li, et al. (2011). "Molecular analysis, developmental function and heavy metal-induced expression of ABCC5 in zebrafish." Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 158(1): 46-55.
4. Tseng, K. Y., A. Caballero, et al. (2011). "Inhibition of Striatal Soluble Guanylyl Cyclase-cGMP Signaling Reverses Basal Ganglia Dysfunction and Akinesia in Experimental Parkinsonism." PLoS One 6(11): e27187.
5. Zhang, Y., Y. Sun, et al. (2011). "Molt-inhibiting hormone from Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis): Cloning, tissue expression and effects of recombinant peptide on ecdysteroid secretion of YOs." Gen Comp Endocrinol 173(3): 467-474.
6. Zheng, X., L. Ying, et al. (2011). "Role of sulfhydryl-dependent dimerization of soluble guanylyl cyclase in relaxation of porcine coronary artery to nitric oxide." Cardiovasc Res 90(3): 565-572.
7. Tsai, E. J., Y. Liu, et al. (2012). "Pressure-overload-induced subcellular relocalization/oxidation of soluble guanylyl cyclase in the heart modulates enzyme stimulation." Circ Res 110(2): 295-303.
8. Andre, L., J. Fauconnier, et al. (2012). "Subendocardial Increase in Reactive Oxygen Species Production Affects Regional Contractile Function in Ischemic Heart Failure." Antioxid Redox Signal.
9. Makiya, M., M. Dolan, et al. (2011). "Structural basis of anthrax edema factor neutralization by a neutralizing antibody." Biochemical and Biophysical Research Communications. ???
10. Skrabalova, J., J. Neckar, et al. (2012). "Antiarrhythmic effect of prolonged morphine exposure is accompanied by altered myocardial adenylyl cyclase signaling in rats." Pharmacol Rep 64(2): 351-359.
11. Ying, L., X. Xu, et al. (2012). "Heterogeneity in relaxation of different sized porcine coronary arteries to nitrovasodilators: role of PKG and MYPT1." Pflugers Arch 463(2): 257-268.
参考文献:
1, Sutherland, et al. Cyclic AMP. Academic Press. Science 174, 392 (1971).
2, Ashman, et al, Biochem Biophys Res Commun, 11, 330 (1963).
3, Honma, M. et al., Biochem. Med.,18, 257 (1977).
4,Goldberg, M. L., Clin. Chem., 23, 576 (1977).
5, Trifilo, R. M. et al., J. Chromatogr., 116, 465 (1976).
背景介绍
1958年Sutherland发现了cAMP(环磷酸腺苷)，并因此获得了1971年诺贝尔生理与医学奖[1].1963年Ashman发现了cGMP（环磷酸鸟苷）[2]。50年过去了，人们已明白cAMP、cGMP是在很多生理过程中发挥重要调节作用的第二信使分子。鸟苷酸环化酶可将GTP催化生成cGMP，cGMP可以被磷酸二酯酶水解成GDP。激活鸟苷酸环化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加细胞内cGMP的含量。cGMP特异性磷酸二酯酶的抑制剂被用来治疗人类的某些疾病，比如cGMP特异性磷酸二酯酶类型5的抑制剂（伟哥和**）被用来治疗ED（勃起功能障碍）；腺苷酸环化酶将ATP催化生成cAMP，cAMP可以被磷酸二酯酶水解成ADP。激活腺苷酸环化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加细胞内cAMP的含量。腺苷酸环化酶激活受体的阻断剂和cAMP特异性磷酸二酯酶的抑制剂被用来治疗人类的某些疾病，比如针对升高cAMP水平的b-肾上腺素受体的阻断剂被用于治疗心律失常、高血压、心肌梗塞和心力衰竭等疾病。
在五十年的研究历程中，从开始研究cAMP，cGMP在各种生理过程中的调节作用，到近几年与之相关的药物研发，药物筛选领域，人们一直在努力寻找一种快速、灵敏、特异性和可重复地定量检测cAMP和cGMP含量的方法。
检测方法演变
cAMP，cGMP分子量分别只有329.21和345.21，在机体内的含量极低，为p mol/L级别，用一般的分析方法无法测定。70年代一系列测定cAMP和cGMP的方法被发明出来，最基本的原理有三种：分别是竞争性蛋白质结合分析法[3]、放射性免疫分析法[4]和薄层色谱法[5]。在80年代，放射性免疫分析法得到了广泛的应用和改进，由于这种方法采用放射性核素标记，应用范围受到一定限制，为了进一步提高检测的灵敏度和操作的安全性，进入90年代又陆续发明了各种酶标记法和化学发光法的竞争性ELISA检测试剂盒，这一类检测方法的根本原理都是基于抗体抗原的免疫反应，所有这些试剂盒中采用的抗体全部是兔抗血清或者是经过特异亲和提纯之后的抗cAMP或cGMP的兔多抗，毫无疑问，兔多抗在约四十年的cAMP，cGMP定量检测中做出了巨大贡献，但同时它也有着明显的缺陷：
1，兔多抗对cAMP，cGMP的特异性不高，会与其他核苷类似分子发生交叉反应，尽管可以通过特异亲和提纯降低交叉，但仍然无法消除交叉；
2，兔多抗对cAMP和cGMP的亲和力受高浓度的二价阳离子（比如Mg2+和Ca2+）的影响；
3，兔多抗在制备的过程中存在个体差异和批间差异，难以保证检测数据的重复性；
4，兔多抗试剂盒在cAMP，cGMP样品的处理上也需要进行乙酰化处理，这与兔多克隆抗体制备方法有必然关系，如果不乙酰化将无法达到检测所需的灵敏度。
所以无论标记方法如何革新，不改进抗体，仍然不能从根本上迎来cAMP，cGMP定量检测的变革。
cAMP和cGMP单克隆抗体成功开发
NewEast Biosciences（纽斯特）公司的科学家经过两年的研发，筛选了4万多个克隆，终于从中发现了高特异性，高亲和力的cAMP和cGMP单克隆抗体。并成功构建了世界上唯一的基于单抗的cAMP和cGMP ELISA检测试剂盒。这个cAMP（cGMP）单抗对非乙酰化的cAMP（cGMP）的特异性识别能力是其对cGMP（cAMP）、ATP（GTP）以及其他核苷类似物识别能力的108倍以上，这相比于以往的多抗试剂盒大大提高了cAMP (cGMP) 检测的灵敏性和特异性，并且极大的降低了试剂盒的批间差异，提供了长久有效地可重复性检测，也彻底摆脱了繁琐的乙酰化过程和对科研人员健康不利的乙酰化挥发试剂。
该试剂盒一经推出，得到了学术界的广泛认可，几年来陆续发表论文十多篇。
已发表论文：
1. Castro, L. R., J. Schittl, et al. (2010). "Feedback control through cGMP-dependent protein kinase contributes to differential regulation and compartmentation of cGMP in rat cardiac myocytes." Circ Res 107(10): 1232-1240.
2. Guo, D., J. J. Zhang, et al. (2009). "Stimulation of guanylyl cyclase-D by bicarbonate." Biochemistry 48(20): 4417-4422.
3. Long, Y., Q. Li, et al. (2011). "Molecular analysis, developmental function and heavy metal-induced expression of ABCC5 in zebrafish." Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 158(1): 46-55.
4. Tseng, K. Y., A. Caballero, et al. (2011). "Inhibition of Striatal Soluble Guanylyl Cyclase-cGMP Signaling Reverses Basal Ganglia Dysfunction and Akinesia in Experimental Parkinsonism." PLoS One 6(11): e27187.
5. Zhang, Y., Y. Sun, et al. (2011). "Molt-inhibiting hormone from Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis): Cloning, tissue expression and effects of recombinant peptide on ecdysteroid secretion of YOs." Gen Comp Endocrinol 173(3): 467-474.
6. Zheng, X., L. Ying, et al. (2011). "Role of sulfhydryl-dependent dimerization of soluble guanylyl cyclase in relaxation of porcine coronary artery to nitric oxide." Cardiovasc Res 90(3): 565-572.
7. Tsai, E. J., Y. Liu, et al. (2012). "Pressure-overload-induced subcellular relocalization/oxidation of soluble guanylyl cyclase in the heart modulates enzyme stimulation." Circ Res 110(2): 295-303.
8. Andre, L., J. Fauconnier, et al. (2012). "Subendocardial Increase in Reactive Oxygen Species Production Affects Regional Contractile Function in Ischemic Heart Failure." Antioxid Redox Signal.
9. Makiya, M., M. Dolan, et al. (2011). "Structural basis of anthrax edema factor neutralization by a neutralizing antibody." Biochemical and Biophysical Research Communications. ???
10. Skrabalova, J., J. Neckar, et al. (2012). "Antiarrhythmic effect of prolonged morphine exposure is accompanied by altered myocardial adenylyl cyclase signaling in rats." Pharmacol Rep 64(2): 351-359.
11. Ying, L., X. Xu, et al. (2012). "Heterogeneity in relaxation of different sized porcine coronary arteries to nitrovasodilators: role of PKG and MYPT1." Pflugers Arch 463(2): 257-268.
参考文献:
1, Sutherland, et al. Cyclic AMP. Academic Press. Science 174, 392 (1971).
2, Ashman, et al, Biochem Biophys Res Commun, 11, 330 (1963).
3, Honma, M. et al., Biochem. Med.,18, 257 (1977).
4,Goldberg, M. L., Clin. Chem., 23, 576 (1977).
5, Trifilo, R. M. et al., J. Chromatogr., 116, 465 (1976).
mark
mark
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号：shixiongcoming
![邻苯二甲酸双(2,2,2-三氟乙基)酯[气液色谱法测定邻苯二甲酸酯的标准]，62240-27-1，阿拉丁](https://img1.dxycdn.com/p/s14/2024/0619/908/6104335618310833081.jpg!wh200)
