【求助】怎样在蓝藻（蓝细菌）中做定点突变（Site-Directed Mutagenesis
丁香园论坛
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各位高手：
本人想在蓝藻中做一个看家基因的定点突变（Site-Directed Mutagenesis），也就是说，用体外合成的点突变后的看家基因替换基因组上的原始基因，在这里请教大家了！
本人想在蓝藻中做一个看家基因的定点突变（Site-Directed Mutagenesis），也就是说，用体外合成的点突变后的看家基因替换基因组上的原始基因，在这里请教大家了！
找到的资料
实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：
第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。
大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。
第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。
对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。
对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。
接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
大家马上就会想到几个问题了：
第一：引物怎么设计呢？
第二：模板怎么去掉呢？
第三：怎么拿到质粒呢？
对于第一个问题：怎么设计引物？
我只能讲一些原则，并举一些例子。
引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：
不过这种突变引物要加上一个原则：
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12base pair。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。
这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：
X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960
现有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924
~undefined*********************************************_************~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~V~F~F~F~F~F~F~8gt~Jdeletion~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0X71661.1_AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT_1020~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984
~undefined**********************************************************~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配）
我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量不至过低，也使引物退火温度升高。
故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG
并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG
其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同时符合引物设计的原则就行了。
引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。
这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链完整，另一链有缺刻的PCR产物
对于第二个问题：
怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。
关于第三个问题：
直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧），验证突变结果，一般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有做不出来的，呵呵，不要砸我啊。
下面讲一下具体的实验步骤以及一些实验中要注意的事情：
1、 根据现有基因设计引物；
2、 合成引物并准备好模板；
3、 PCR，
4、 DpnI处理酶切产物；
5、 转化酶切产物；
6、 筛选 阳性克隆；
7、 送测序并测全长。
最后就是庆祝啦，呵呵，没什么复杂的。
引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
那种Quick change试剂盒分为几种不同的类型
什么QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。
另外，DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。
实验板长出来的菌有两种可能
一种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的
（突变体）
不过这两种菌长得一模一样^_^，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的，
做PCR时也最好做一个负对照（不加引物），
实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。
如果两者都拿去DNPI处理
就能够证明模板已经被去除干净。
若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。
如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好，
如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。
如果正对照很多菌，负对照有几个菌，那么就是DPNI处理得不干净，这个时候就得靠运气了
实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：
第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。
大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。
第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。
对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。
对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。
接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
大家马上就会想到几个问题了：
第一：引物怎么设计呢？
第二：模板怎么去掉呢？
第三：怎么拿到质粒呢？
对于第一个问题：怎么设计引物？
我只能讲一些原则，并举一些例子。
引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：
不过这种突变引物要加上一个原则：
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12base pair。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。
这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：
X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960
现有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924
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我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量不至过低，也使引物退火温度升高。
故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG
并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG
其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同时符合引物设计的原则就行了。
引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。
这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链完整，另一链有缺刻的PCR产物
对于第二个问题：
怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。
关于第三个问题：
直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧），验证突变结果，一般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有做不出来的，呵呵，不要砸我啊。
下面讲一下具体的实验步骤以及一些实验中要注意的事情：
1、 根据现有基因设计引物；
2、 合成引物并准备好模板；
3、 PCR，
4、 DpnI处理酶切产物；
5、 转化酶切产物；
6、 筛选 阳性克隆；
7、 送测序并测全长。
最后就是庆祝啦，呵呵，没什么复杂的。
引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
那种Quick change试剂盒分为几种不同的类型
什么QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。
另外，DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。
实验板长出来的菌有两种可能
一种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的
（突变体）
不过这两种菌长得一模一样^_^，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的，
做PCR时也最好做一个负对照（不加引物），
实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。
如果两者都拿去DNPI处理
就能够证明模板已经被去除干净。
若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。
如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好，
如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。
如果正对照很多菌，负对照有几个菌，那么就是DPNI处理得不干净，这个时候就得靠运气了
希望有所帮助
你好，谢谢你的回复。但是你所说的是在体外做定点突变，而我想做的是在蓝藻体内的定点突变（invivo Site-Directed Mutagenesis），请问怎样操作呢？
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