【求助】两次PCR电泳目的片段长度不一样，为什么
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我分两次提的心肌的RNA，同是我的空白组。然后PCR、电泳，但是电泳后的目的片段长度第一次在200bp左右，第二次在300bp左右，而200bp左右的才是我要的目的片段。到底是怎么回事啊，大家有没有遇到过这种诡异的事情。
理论上不会出现这样的情况，你再做一次看看结果怎么样，中间的操作有没有什么不一样的？
操作都是一样的。第一次做的一个样，因为第一次做，比较精细，第二次做的三个样，有点粗糙，尤其是用液氮研磨组织的时候。其余应该都没有什么问题。还有第一次提取的RNA跑了电泳的，三条带非常清楚，第二次就没有跑了，直接反转录的。
所以还是从头到尾再做一次看看到底怎么回事
所以还是从头到尾再做一次看看到底怎么回事
lvxue1021 wrote:
我分两次提的心肌的RNA，同是我的空白组。然后PCR、电泳，但是电泳后的目的片段长度第一次在200bp左右，第二次在300bp左右，而200bp左右的才是我要的目的片段。到底是怎么回事啊，大家有没有遇到过这种诡异的事情。
无图无真相。在我看来，有的时候由于电泳条件的变化可能导致电泳迁移率的些微变化是存在的，你可以把图贴出来大家看看
如果你采用的核酸嵌入染料是花青染料（如GEL STAR)的话有可能会影响迁移率，导致片段大小不同的假象。
建议你 将第二次的三个样品 再重新提取RNA 严格按照实验的操作和要求来进行，如果是中间出现什么问题的话，实验结果是很难解释的，另外，建议用液氮研磨的时候，如果样品不是很多的话，尽量是一个 样品一个研钵，以免交叉污染。
lvxue1021 wrote:
我分两次提的心肌的RNA，同是我的空白组。然后PCR、电泳，但是电泳后的目的片段长度第一次在200bp左右，第二次在300bp左右，而200bp左右的才是我要的目的片段。到底是怎么回事啊，大家有没有遇到过这种诡异的事情。
200 和300，这个差别也是肉眼估计出来的，在实际电泳过程中，电压，胶浓度，或是提取过程中的某些试剂或者杂质影响，都有可能造成迁移率的变化。上面战友们已经分析了一些具体原因呢，其实我有的时候也会在小分子量的片段上出现这种现象。我个人经验是，你将这两个片段克隆后，做个pcr验证一下，同时送去测序，这估计是最直接的证据判断你得到的产物是不是目的序列。
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