【讨论】为什么筛个稳转株这么难

现在用pEGFP-IRES2载体转染黑素瘤B16F10细胞 筛选前转染效率有20% 先1：10传代 再用700-1100mg/L G418分组筛选 基本3天后就没什么绿的了 我晕 两个月啦 就这么耗时间 后面实验。。。

大家有什么建议啊

你可以考虑换个高转染效率的方法，比如用病毒构建稳定细胞

G418浓度太高了，一般筛选浓度为400ug/ml

在做稳定细胞株之前首先要摸清楚G418的使用浓度，不同细胞对G418耐受性是不一样的，一般选择10-14天左右杀死全部细胞的G418作为后期筛选浓度。

另外，楼主细胞转染效率太底了，才20%，即使转进去了也不一定整合到基因组里面。

B16F10是有名的难转细胞株 能转到这么高 应该不错了吧～～～

我刚转的，用PEI，效率可以达到40-50%，很好建立稳定细胞系

我做过pEGFP-IRES2的稳转 MCF-7和231细胞

还是能做出稳转单克隆的 但效率比较差

因为很多细胞对G418都有抗性

所以G418筛出的 最后绝大多数是假阳性

但有荧光嘛 还好说

ls说能有40-50%的效率 不知道用的是什么细胞



ps：G418筛选稳转 基本可以淘汰了