【求助】如何证明一个蛋白参与一个信号通路

我有A蛋白的转基因鼠和对照鼠。想证明A蛋白参与anti CD3激活的T细胞受体TCR信号通路。TCR激活后可以激活ras，MEKK,MEKKK等。是不是我首先看各通路下游的蛋白磷酸化水平在两种鼠之间有无差异。有差异再向上寻找？是可以通过这个初步筛选吗？
第一次做信号通路，希望得到大家的帮助。谢谢！

先不要找参与哪一条通道，先要确定是否参与anti CD3激活的T细胞受体TCR信号通道。
可以用常规的活化T细胞的方法（anti-CD3和anti-CD28）刺激实验组T细胞和对照组T细胞，比较两者之间的增殖能力，分泌细胞因子的能力是否有显著差异。如果有，那么可以说明你的A蛋白参与此过程，然后再进一步做实验，研究其机制问题。

非常感谢您的回答。我看好多做信号转导的都做MTT分析，是不是如果激活了信号通路，那么细胞的增殖将会增加？分泌因子的能力也会增加？

T细胞的活化是比较复杂的，有些活化剂能够促进其增殖并且使其分泌细胞因子，有的只能活化T细胞，不能使其增殖。
anti-CD3一般需要结合anti-CD28才能使T细胞增殖。

我看有文献说是在包被有anti－CD3的皿上培养就可以激活T细胞。不知道您说的如果要anti－CD3和anti-CD28联合的话，一般是怎么做？不知道能否提供一些书或文献以供学习。非常感谢！

只有anti-CD3无法完全使T细胞活化而使其增殖，必须还要有anti-CD28的信号才能使其完全活化。你看T细胞增殖的有关文献一般都会看到使T细胞增殖必须要有这两个信号（TCR信号和辅助性因子信号）。
联合加的话很简单，只要加两个抗体就行了，一般包被有抗体的板子都会包被这两个抗体，很少只包被一个抗体的。没有包被的板子直接加入抗体也是可以的。

如果加了anti－CD3或anti－CD28，那不就是加了刺激因素了？那样研究的是不是就是影响增殖的通路？是不是如果我就想看我这个基因敲出对于T细胞影响那我就什么都不用加？呵呵刚开始涉及这个问题，所以不太懂。非常感谢您的回答。

你不加刺激，细胞就不会增殖，那你还怎么研究它对增殖的影响？

非常感谢您的回答。
还有一个问题。我看好多文献都是用抗体包被96孔板，难道不能直接加在培养基内？这和包被后有什么区别呢？我上次做了一次，好像两者没有差别，另外两天后和0天的也没有差别。我怀疑我包被不成功，想直接加在培养基内，不知道是否可以？

包被和直接加效果一样，没有区别。
用anti-CD3和anti-CD28刺激T细胞增殖至少需要5天。
建议你多看看相关文献，全面了解你所使用的方法了之后再着手自己做实验。