丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

【求助】siRNA沉默的效果是暂时的?

丁香园论坛

18385
一篇国外文献中提到,细胞的某种基因被siRNA后,此基因的表达水平仅暂时降低,随着细胞分裂的进行,水平会回升。是这样的吗?难道siRNA沉默不是永久性的吗?谢谢!
如果是永久性的,那基因敲除的动物模型就没有用了。
siRNA沉默的水平,根据基因性质,会维持或长或短,但是不是永久性的。
不单在细胞水平,就是体内也不可能是一劳永逸的!生命的复杂性就在于其弹性(始终处于平衡状态),这样才能保证细胞能够应对不同的生理状态。
siRNA抑制是暂时的,对于体外培养的贴壁细胞而言,最多可以抑制8天,随着细胞不断分裂,siRNA(本身是不能像质粒那样复制的)逐渐被稀释,其抑制效果逐渐降低。
相比siRNA,shRNA的抑制效果是相对永久的。
siRNA是人工合成的双链RNA,随着细胞复制进行逐渐稀释,通常用于瞬时转染,一般2-3天。
shRNA是由能够产生此双链RNA的表达载体表达出来的,然后剪切成siRNA起作用,因此相对时效长一些,如果是稳定转染的表达质粒,就可以稳定表达。
这两种方法可以互补使用,瞬时表达可检测潜在的直接靶下游,还可以收时间梯度进行动力学分析,稳定表达可以检测一系列下游靶效应。不过发文章的话一种就够了。
bigbang_0_0 wrote:
siRNA抑制是暂时的,对于体外培养的贴壁细胞而言,最多可以抑制8天,随着细胞不断分裂,siRNA(本身是不能像质粒那样复制的)逐渐被稀释,其抑制效果逐渐降低。
相比siRNA,shRNA的抑制效果是相对永久的。


说的有道理。同意楼上观点
病毒呢,比如慢病毒的shRNA也是暂时的吗,筛出的稳转株也不行吗
病毒呢,比如慢病毒的shRNA也是暂时的吗,筛出的稳转株也不行吗
G418或者流式筛出的稳定细胞株一般是认为是永久的。
shRNA是整合到基因组上的,能不断产生siRNA,但是转染也不是永远不变的。所以只能说是相对永久。
siRNA只是外部所加的一些RNA,就像培养基里的抗生素。总会消耗光的。。
当然你如果想延长干扰效果,可以不断地加siRNA
学习中
慢病毒的shRNA可以整合到目的基因组,质粒的shRNA不能整合到基因组吧?因此它的干扰效应也不是永久的吧
请高手讲一下
shRNA的暂时性大概不取决于转染方式吧,shRNA虽然相对稳定,但是主要由RNA聚合酶III转录吧,III相对容易被调控,所以具体可能还得看看RNAploymeraseIII的特点
学习了。谢谢各位老师。
为什么不可以是永久性的?

siRNA进入细胞内/体内后会逐渐降解。从这个角度讲其作用是暂时的。

但是,如果siRNA的靶基因是一些特殊基因,比如只在特定发育阶段表达的基因,那么其所造成的效果有可能是永久性的。
waterbeijing wrote:
siRNA是人工合成的双链RNA,随着细胞复制进行逐渐稀释,通常用于瞬时转染,一般2-3天。

siRNA knock down 的效应至少可以持续10余天,我曾经测过AKT1 siRNA转染15天的效果,仍然很好。事实上Dharmacon做过测试,他们的siRAN沉默的效果至少可达10余天,所以不至于只有2-3天,有兴趣的站友可以自己试试,做做time-course实验。
另外,从我个人的经验来看,Dharmacon是在siRNA领域的老大,这个公司的产品非常值得信赖,并且服务非常的好,我曾经用一种integrin的siRNA转SW620 cell,试了不行,打电话给技术支持部门,公司先后将这种integrin
的所有siRNA都免费寄给了我,居然都不行,后来才发现不时由于siRNA本身不行,因为我用另外一种类似细胞系,用同样的方法,就得到非常好的结果,SW620这种细胞是有名的难转,所以大家以后碰到不work的siRNA,you may contact HDharmacon technical support to get free replaced siRNA.
zhoushaolai99 wrote:
G418或者流式筛出的稳定细胞株一般是认为是永久的。

同意!!
zhoushaolai99 wrote:
G418或者流式筛出的稳定细胞株一般是认为是永久的。


此类细胞株,在不加药的情况,干扰效果会逐渐消失。哪怕是用慢病毒做出来的,都是这样。
学习了,谢谢
学习了,谢谢!
学习了,谢谢
1
siRNA干扰肝癌细胞HepG2持续的时间就只有2-3天,但在转录水平的干扰可以是长久的,不是吗?
在非哺乳动物细胞内,sirna的效应阶段还存在着随机降解多聚酶链反应模式 。该模式类似于PCR的反应过程,可使RNAi的效应放大,把最初的信号进行放大,使基因沉默变得更加有效。siRNA在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-directed RNApolymerase ,RdRP的作用下,以靶向mRNA为模板合成靶向mRNA的互补链,使单链mRNA成为dsRNA,然后在Dicer酶的作用下被降解形成新的siRNA,新的siRNA还能与另外的靶向mRNA发生上述反应,这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA,迅速、有效地抑制mRNA的水平。现在己经在霉菌、植物和无脊椎动物中发现了数种参与RNA i的RdRP.
在哺乳动物细胞内,由于没有RdRP,就存在着sirna效应的降低
Dharmacon虽好,但是非常的贵,量也很少。
不是每个人都用得起。
学习了,谢谢
@依然燃 ,请问你看到的是哪篇文献中提到细胞的某种基因被siRNA后,此基因的表达水平仅暂时降低,随着细胞分裂的进行,水平会回升的?能否告诉我一下?我邮箱是382565907@qq.com
2013小马哥 wrote:
@依然燃 ,请问你看到的是哪篇文献中提到细胞的某种基因被siRNA后,此基因的表达水平仅暂时降低,随着细胞分裂的进行,水平会回升的?能否告诉我一下?我邮箱是382565907@qq.com

不用看文献啦 是常识呀~
siRNA是合成的 不会复制
转进细胞自然会慢慢降解 细胞分裂也会丢失
沉默效果维持一周就不错了

本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

师兄微信号:shixiongcoming

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序