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解析两大荧光定量技术机理

信科奥达

4636

Real Time PCR法是实时监测解析PCR扩增量的方法。因其无需电泳,大大减低了实验污染的机率,且具有快速、可对检测靶基因定量而倍受青睐。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差,提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞、细菌等mRNA表达量的变化;比较不同组织的mRNA表达差异;验证基因芯片,siRNA干扰的实验结果。

一、荧光定量技术需要的配套设备

1、荧光定量PCR仪
ABI 7900荧光定量PCR仪
Lightcycler 240荧光定量PCR仪
2、离心机 
Heras低温高速离心机
Beckman低温高速离心机

二、荧光定量技术检测方法

1、TaqMan探针方法
该技术以美国 ABI 公司为代表。 PCR 扩增时,在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸片断,两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团,在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中,包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号(图4)。所以,每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。


图1 TaqMan探针的荧光信号产生机制

2、SYBR Green I嵌合荧光法
SYBR Green I荧光染料技术原理:SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料(图2)。当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。因此,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是:1、开始反应,当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时,SYBR Green染料释放出来,荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后,SYBR Green染料与双链产物结合,定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。


图2 SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合

SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合,对DNA模板没有选择性,所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果,对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下,本法是一种成本低廉的选择。

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