丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
丁香通
点赞
收藏
wx-share
分享

基因修饰小鼠模型在肿瘤学研究中的应用

互联网

5869

前言

相对于过去常用的肿瘤细胞接种和免疫缺陷小鼠模型,基因修饰小鼠(GEM)模型是建立在天然完整免疫条件下的原发(de novo) 肿瘤,因此,作为肿瘤学研究的工具, GEM 模型更能模拟人肿瘤的组织病理学和分子学特征,表现为有更好的遗传异质性,其优势在于能反映肿瘤细胞自身,以及肿瘤微环境中细胞等相互作用因素,包括具有引起原发肿瘤开始形成到发展为转移性疾病的能力。GEM 模型的建立及应用极大促进了肿瘤学研究领域发展与进步。目前,GEM 模型已成功应用于验证潜在肿瘤基因与药物靶点,考核治疗效果,分析肿瘤微环境影响,以及评价药物耐药性机制等研究领域。而且,结合临床病人研究与构建更加合理有效的 GEM 模型,优化肿瘤干预的临床前试验,无疑将进一步促进肿瘤治疗新策略的研发,提高其有效转化为临床上实际应用的成功率。

目前肿瘤学研究面临的主要挑战

肿瘤学研究及肿瘤治疗在临床上仍然面临着许多挑战,其中抗肿瘤药物耐受性的形成和肿瘤转移性疾病是当前面临的两个重要现实难题。抗肿瘤耐药性的产生是由于异质性肿瘤中的原发突变的出现,或治疗前耐药克隆的大量生长引起的,而现有靶向抗肿瘤制剂的单一疗法,或化学药物疗法都无法避免药物耐受的发生。而且,在获得明显成功治疗之后,少量药物耐受肿瘤细胞可以存活下来,并在一定时间后,成为主要细胞群,最终形成与原始肿瘤表型不同复发疾病。而肿瘤转移性疾病则是导致超过 90% 以上与癌症相关死亡的原因,因为现在对于这些继发肿瘤也多无有效的治疗方法。近年来,虽然针对干预肿瘤病人免疫系统的肿瘤免疫疗法取得了一些令人鼓舞的进展,但该疗法也只是对一些特定病例情况下有效果,而对于大多数肿瘤病人仍不具有实际临床意义。

所谓成功的肿瘤治疗往往需要多种方法的协同作用,比如手术,发射线照射,细胞毒性疗法,以及免疫疗法等综合策略。为了设计出有效合理的综合治疗措施与方案,首要的基础与前提是深入了解肿瘤的形成与发展,转移,及治疗应答过程中,肿瘤细胞自身及其微环境细胞间相互作用的机制,从而寻找针对不同的肿瘤类型最有效的治疗方法。为了实现这一目的,研究者们就必须依赖于动物模型的临床前研究。过去尽管依赖于传统临床前小鼠模型,即通过建立移植人肿瘤细胞系或同种小鼠肿瘤细胞系模型等方法,获得了临床前抗癌新疗法的成功验证,但绝大多数的这些新疗法在临床 III 期试验中却都最终以失败而告终。

总体上讲,由于传统体内肿瘤小鼠模型在预测临床新疗法效果方面的表现不佳,因而更加凸显寻找具有更好预测能力及效果的改进型临床前体内模型的意义与价值。最近在基因修饰技术方面的进步与发展,使得快速研制能更有效模拟人肿瘤的 GEM 模型成为现实,GEM 模型在遗传组成,肿瘤细胞与其肿瘤微环境的相互作用,药物反应及耐受等方面都更接近肿瘤病人。而新一代 GEM 模型的出现,也大大促进抗肿瘤新疗法策略转化为临床应用,最终达到有助于提高癌症病人生存率的目的。

肿瘤学研究中常用传统小鼠模型的优势与不足

50 年前首先在裸鼠体内移植人 / 鼠肿瘤细胞系而建立的小鼠肿瘤移植模型成为肿瘤研究中常用的小鼠模型,这类移植模型可快速测试潜在肿瘤及转移相关基因,并成为临床前的药物试验主要工具。例如,通过异种移植研究有助于揭示结肠癌(CRC)对药物(如 Vemurafenib) 在小鼠体内的耐受机制,从而实现在临床试验中对 CRC 病人启动了同时针对突变 BRAF(如 V600E)和 EGFR 的靶向联合疗法,表明这类异种移植模型在建立新的联合治疗策略方面的实际意义。

异种移植研究也有助于发现特定基因表达特征,研究其介导的器官特异性定位转移的特点。如应用该种模型证实了传播的乳腺癌细胞存在于血管附近,这为调控这些传播的乳腺癌细胞提供了可能的对策。而且,应用这类细胞系移植的体内模型研究,也为抗肿瘤免疫,T 细胞耐受机制,肿瘤免疫逃逸途径等提供了许多基本的认识概念。这些发现都为目前进行中的肿瘤免疫疗法的突破奠定了基础。

然而,由于肿瘤细胞系一开始就含有许多突变,而且在体外长时间培养过程中,还会产生额外突变,因此,此类接种模型难以真实反映人肿瘤细胞的形态学和遗传异质性,从而降低了该类模型作为临床应用效果预测性的可靠性。另外,为了防止可能的排斥反应,肿瘤细胞系的异种移植模型是建立在免疫缺陷小鼠基础上,这也限制了其应用于肿瘤发展中免疫系统以及治疗应答等领域的研究。

不同于细胞系移植模型,通过将新鲜人肿瘤活检物移植至免疫缺陷小鼠构建的病人来源的肿瘤移植(Patient-derived tumor xenografts,PDTX,或 PDX)模型则具有更多优势,PDX 小鼠模型的肿瘤保留了来自肿瘤病人在分子,遗传,组织学异质性等特征(甚至经过小鼠体内的传代几代之后)。所以,PDX 模型也成为目前个性化医学和临床前药物筛选的有用工具。

目前,PDX 的大规模研究已应用于潜在临床药物预测试验。有研究者通过构建约 1000 个来自多元化不同类型突变的 PDX 模型,并应用这些不同的 PDX 模型对不同药物进行小鼠体内筛选,寻找药物与肿瘤基因型之间的关联性,以达到试验重复性和临床可解释性的统一。最近有应用三阴乳腺癌建立的 PDX 模型,结合单细胞基因表达分析证明,早期细胞表达特征标记主要为干细胞样基因,发现了具有阻断乳腺癌转移的潜在药物新靶点。

不幸的是,PDX 模型在研究某些肿瘤类型方面(如雌激素受体阳性的乳腺癌和前列腺癌)的不满意效果成为了限制其应用的主要障碍。而且,PDX 模型必须建立在免疫缺陷小鼠上,这样的小鼠缺乏由获得性免疫系统介导的天然抗肿瘤与促肿瘤活动。

研究者们也明白,虽然 PDX 模型缺乏功能性的获得性免疫系统,该模型仍可为临床提供有价值的研究资料。正在进行中的相应改进努力是通过移植人 CD34 阳性造血干细胞或前体细胞的方法,实现重建人免疫系统的人源化的小鼠模型,也取得了显著的成功。虽然来自某些特异谱系的人免疫细胞在小鼠体内的重建仍具有挑战性,但通过引入人相关细胞因子,趋化因子,生长因子等方式,获得增加人骨髓细胞在小鼠体内发育与成熟的效果。

为了构建优化的能够支持人 HLA 限制性 T 细胞发育的免疫缺陷小鼠,应用基因修饰技术建立将人 HLA 分子引入至敲除小鼠 MHC 类型 I 和 II 相应区域的人源化小鼠模型。人源化小鼠模型能作为免疫疗法临床前评价的有用平台,然而,当人造血干细胞供体来源(如通过脐带血或胎肝)有限时,其现实操作中的较高构建成本也自然成为该模型实际应用的不利因素了。

应用不断完善 GEM 模型研究原发肿瘤

上世纪 70 年代成功建立小鼠原核注射转基因技术以后,借助该方法于 1980 年代早期第一次将克隆癌基因导入小鼠基因组中,成功制备了所谓的致癌小鼠(Oncomice)。 该致癌小鼠是应用乳腺特异性起动子(MMTV)特异性表达癌基因 v-HRas 的第一个肿瘤 GEM 模型,该致癌小鼠的首次构建成功,并证实了该小鼠形成原发乳腺肿瘤。极大地振奋了肿瘤研究领域团体,因为此研究结果是第一次真正证明了癌基因在正常细胞中表达能产生肿瘤的假说。1992 年伴随着小鼠胚胎干细胞(ES)基因打靶技术的突破发展,成功构建肿瘤抑制基因(TSG)敲除小鼠,也证明了该类 TSG 基因在肿瘤发生过程中的重要作用。

虽然致癌小鼠和 TSG 敲除小鼠提供了非常有价值的理论依据,但这两种模型也存在其局限性。由于转基因技术是种特定组织中所有细胞表达外源基因,TSG 敲除小鼠是灭活体内所有细胞中的相关基因。然而,现实肿瘤形成过程是在个体中整个组织器官健康的前提下,由于某个单细胞中某种遗传变异的积累而导致的分散肿瘤现象。为了符合肿瘤形成过程的实际情况,更有必要设计与构建更加合理或复杂小鼠模型,比如能实现条件性的在体细胞灭活肿瘤抑制基因,或者激活(突变)致癌基因的所谓条件性 GEM 模型。条件性 GEM 模型构建的基本原理是将需要修饰基因两端分别加上 loxP 重组位点,在特定 Cre 重组酶存在的情况下,loxP 两端之间的 DNA 就可被敲除,达到特定条件下灭活该基因的目的。应用这种模型的第一个成功例子是应用 Cre-loxP 系统介导的体细胞灭活 Apc 基因而构建的小鼠结直癌模型。应用腺病毒载体实现 Cre 重组酶特异性表达于肠上皮细胞,组织特异性敲除 APC 基因,引起小鼠快速形成散在结直腺瘤,其特征与家族性结肠腺瘤性息肉病(FAP)病人有许多相似性。所以,通过发现特异性相关癌症基因的突变体,研究者们可构建能更能模拟肿瘤病人在组织学上,分子学上,以及临床上相似特征的小鼠模型。

借助 Cre-ERT 融合蛋白诱导系统,研究者们可实现对体细胞中相关靶基因在特定时间与特定组织实施修饰,即将雌激素受体的突变激素结合区域与 Cre 重组酶融合在一起,建立可诱导调控的 Cre 重组酶表达系统,当在雌激素类似物如 Tamoxifen 存在的情况下,引起 Cre 重组酶活性在翻译后激活,使其发挥识别 loxP 位点作用,实现诱导性切割靶基因的目的。因此,LoxP 小鼠(即靶基因 DNA 两端分别含 loxP 位点)的条件性基因修饰,通过在选择的时间里加入诱导剂 Tamoxifen 后,控制 Cre-ERT 的特异性表达,达到对靶基因进行时空与区域上特定修饰。

虽然 Cre-loxP 系统能用于多于一个基因的修饰,但因这种过程是同时发生的,因而难以完全模拟肿瘤多步骤形成过程中,突变是逐渐积累形成过程的特征。最近,研究者们利用可独立发挥作用的可诱导双重组酶系统(如 Flp-FRT/Cre-loxP,或 Cre-loxP/Dre-rox),建立了对靶基因表达实施先后调控的修饰方式。该技术方法成功应用的实际意义有如下几方面,1. 独立研究针对肿瘤细胞的自主和非主发通路与过程;2. 实现模拟人多步骤的癌症形成过程,有续地进行诱导突变;3. 开展独特肿瘤治疗靶点遗传性评价。

肿瘤 GEM 模型构建策略与技术方面的改进

GEM 模型因其独特优势已经被证实是肿瘤学研究的有效工具,但研究者们也一直努力对其进行着不断改进与完善。由于该类小鼠模型在构建与研制过程中周期长,工作量大,以及成本高等原因,特别是对于多个等位遗传位点进行修饰,构建具有遗传特性的新突变小鼠模型时候,研制过程则更耗时,且需要更长久的交配繁殖过程。这也成为限制具有遗传能力 GEM 模型广泛实际应用中的一个主要因素。近年来,由于肿瘤基因组序列研究技术的广泛普与应用,伴随着新发现的癌症相关基因突变数量的快速增长,更加需要建立快速新颖的小鼠模型研制策略,实现在体内快速验证潜在致癌基因,以及已知病人相关突变的非遗传修饰 GEM 模型的目的。目前这方面的进展主要有:ES 细胞为基础的肿瘤模型;应用 CRISPR/Cas9 技术基因组编程;肿瘤病人相关位点的改善肿瘤模型。

1. ES 细胞为基础的肿瘤模型

为了进一步加快新型人肿瘤 GEM 模型研制,利用将小鼠胚胎干细胞(ESC)经过基因修饰后而作为非遗传修饰(如嵌合体)小鼠直接进行肿瘤学研究已成为一种研究策略。最近报道的 GEM-ESC 策略,即建立以 ES 细胞为基础的肿瘤 GEM 模型。该类模型是在原有基因修饰的基础上,快速构建新型基因遗传修饰小鼠模型。例如,应用 GEM-ESC 策略,在原有 K14cre-Brca1-Trp53(KBIP) 的小鼠乳腺肿瘤模型的 ESC 上,直接导入 MET 原癌基因,构建新型 KBIP-MET 的转化乳腺癌模型。研究结果表明,与 KBIP 小鼠相比,此 KBIP-MET 小鼠形成的乳腺癌更具有转化特征,表现为更容易形成癌肉瘤。在对肿瘤药物的反应性上,KBIP 小鼠模型的乳腺癌对临床 RARP 抑制剂(如 Olaparib) 敏感,而 KBIP-MET 小鼠模型的转化乳腺肿瘤则显示对该抑制剂具有耐受性。

2. 应用 CRISPR/Cas9 技术的基因组编程

过去十年,伴随新的基因组编程技术(如 ZFNs 和 TALENs)快速发展,到 2013 年出现的 CRISPR/Cas9 基因组编程系统,该类基因组编辑技术成为继 PCR 技术发展以来,过去几年生物学研究领域的革命性进步及影响力最大的技术更新。CRISPR/Cas9 系统首先发现于原核生物中针对抵抗外来入侵遗传物质而建立的免疫系统,并很快被成功用于各类物种的基因编辑。借助单一的引导 RNA(sgRNAs), Cas9 核酸酶成为能特异性作用于基因组如何基因位点,达到基因敲除的目的。通过应用 Cas9 诱导的 DNA 断裂和单链核苷酸 / 供体 DNA,该系统也可实现对特定基因突变,或特定插入 loxP/FRT 重组位点等遗传修饰。

CRISPR/Cas9 技术系统所表现出同时对基因组不同位点进行有效编辑等基因打靶策略特征,立刻成为快速研制肿瘤小鼠模型的最佳选择。目前在人肿瘤病人观察的所以遗传突变都可以通过基因修饰的方法而快速地构建相应小鼠模型,包括条件性基因敲除,点突变,易位等。另外,也有研究者应用 CRISPR/Cas9 技术对小鼠的致癌基因和 TSGs 进行了体细胞(非遗传性)编辑,因此研究策略的努力与成功,使该系统成为研制肝细胞肿瘤,肺癌,脑癌,胰腺癌,以及乳腺癌的非遗传修饰模型的新方法。

最近,CRISPR/Cas9 系统也应用于靶基因的抑制(CRISPRi)或激活(CRISPRa) 的遗传修饰。这类修饰系统可用于研制相应致癌基因,和 / 或抑制 TSGs 基因的诱导和可逆激活小鼠模型。比如借助 CRISPRa 为基础的系统,通过激活致癌基因的转录,达到研究其致癌潜力的目的。

虽然 CRISPR/Cas9 为基础的基因编辑系统非常具有潜力,但该系统应用于体内基因编辑也存在一定的缺陷,比如,目前该系统策略不适合于验证潜在致癌基因的致癌潜力。另外,将 Cas9 导入体细胞的基因编辑方式,可引起 Cas9 特异性免疫反应,导致 Cas9 表达细胞被清除的可能性。为了避免这些可能潜在风险,可选择在免疫缺陷小鼠体内进行相应的实验,或在通过基因修饰方法,首先获得对 Cas9 具有免疫学耐受小鼠模型后,再开展相应的动物实验。最后,虽然已有报道表明,应用引起 DNA 单链断开的可诱导 Cas9n 缺口酶,可以降低其脱靶效应, 但研究者在实际应用中必须有清晰认识,要想完全避免由 CRISPR/Cas9 介导的非设计所需要的脱靶突变是很难的。

3. 肿瘤病人相关位点的改善肿瘤模型

构建理想的肿瘤病人相关突变模型,对研究靶基因在肿瘤发生过程中的作用,以及有效评价药物效应就显得更加具有必要性与实际意义。因为在人肿瘤抑制基因(TSGs)中,许多具有肿瘤发生趋势的生殖细胞突变和体细胞突变都是错义或无义突变,从而导致突变产物或可能带有功能截短蛋白的形成。这类突变现象是难以通过条件性敲除小鼠模型来实现的,因为条件性基因修饰策略是将靶基因中某个或几个外显子完全敲除,达到灭活靶基因功能。一些研究结果已经表明,参照肿瘤病人相关 TSG 突变构建的小鼠突变模型,可引起与靶基因完全敲除不同表型。比如,与 Trp53 基因敲除小鼠比较,病人相关的 Trp53 热点突变小鼠表现有更加明显的致癌活性。

同样,构建 BRCA1 乳腺癌病人相关的 Brca1 基因突变的条件性小鼠模型研究表明,与 Brac1 完全敲除小鼠模型相比,引起 Brac1 基因中特定 RING 区域突变导致的乳腺肿瘤,研究也证实,由于突变导致 Brac1 蛋白含有较少的 RING 活性 表现为更容易对那些破坏 DNA 的药物产生耐受性,该结果有助于揭示了这些突变与治疗反应效果之间的因果关系。

GEM 模型在肿瘤学研究中的应用范围

作为原发肿瘤发生的 GEM 模型,可成为体内分析包括肿瘤形成,发展及转移中肿瘤形成等过程中细胞本身与细胞间相互作用的系统选择。人肿瘤 GEM 模型也已成功应用于验证候选药物靶点,评估治疗效果,以及评价药物耐受机制等方面。由于 GEM 模型是在完整免疫系统小鼠体内形成的原发肿瘤,因此,该类模型更适合潜在肿瘤免疫治疗的探索性研究。小鼠与人紧密相关性研究为探索与开发肿瘤治疗新方法与策略,提供了有意义的应用平台。也为设计和开发新抗肿瘤治疗,提供了临床治疗效果等相关信息。GEM 模型在以下几个方面对肿瘤生物学及转化肿瘤学等研究进展及贡献中发挥了重要作用。

1. 验证潜在癌基因

在大量肿瘤样品测序研究获得不断增加的潜在肿瘤基因基础上,建立体内快速验证这些潜在肿瘤相关基因的策略是非常必要和有实际意义的。考虑到速度和相对简单化因素,GEM-ESC 和 CRISPR/Cas9 技术可作为快速验证潜在肿瘤基因的首选方法。特别是应用基于体细胞的 CRIPPR/Cas9 介导基因编辑技术,建立非遗传修饰的小鼠模型,实现高通量体内验证潜在肿瘤基因的目的。比如,应用 DNA 注射与活体电穿孔法相结合的转染方法,将针对引起胰腺管腺癌(PDAC)的 13 个不同主要肿瘤抑制相关基因的 15 个 gRNAs/Cas9 表达质粒混合物一起导入成熟小鼠的胰腺,构建同时修饰此 13 个基因的小鼠模型。结果显示,此 PDAC 小鼠有超过 60% 的这些靶基因显示基因敲除,提示 CRISPR/Cas9 介导的突变诱发了肿瘤的形成。同样,利用 Dox 诱导 Cas9 表达的 GEM 模型也被用于验证已知多种肠道肿瘤基因(如 Apc 和 Trp53)。除了修饰 TSGs, CRISPR/Cas9 技术还应用于验证染色体重排的致癌性,如在肺癌病人观察到的 Eml4-Alk 基因的融合现象。

另外,应用 GEM 模型对来自临床病人筛选获得的候选潜在癌基因进行验证,也已成为研究肿瘤相关基因功能的常用策略。例如,最近胡卓伟教授课题组通过构建条件性过表达和敲除 GEM 模型,研究假激酶 Trib3 基因在促进急性早幼粒细胞白血病(APL)形成中的作用,结果表明,同时在小鼠骨髓细胞中特异性表达或敲除 Trib3 与 致癌蛋白 PML-RARa (PR) 融合基因,Trib3 基因可显著增加 PR 诱发 APL 形成的作用。而吕毅教授课题组则是通过构建 Y 染色体性别决定区(Sry) 基因特异性表达的 GEM 模型,首次证实了在肝组织内特异性过表达 Sry 基雄 / 雌小鼠对化学致癌剂(DEN)诱导小鼠肝细胞癌(HCC)形成更加敏感,提示 Sry 基因在 HCC 形成过程中发挥了重要促进作用。

2. 研究致癌基因的依赖性

致癌基因依赖现象是指某些肿瘤形成完全依赖于单一致癌基因。由于条件性 GEM 模型对基因的修饰是不可逆的,因而不适合研究致癌基因依赖性。因此需要选择不同的调控诱导策略进行相应的研究,例如将致癌基因与 ERT 融合达到控制其表达的目的。有研究报道,将 Trp53-ERT 变异体取代内源 Trp53 建立的纯合敲入小鼠,该 Trp53-ERT 小鼠只有在 Tamoxifen 存在条件下,诱导 Trp53 的表达,并在已形成肿瘤小鼠模型的基础上,研究再恢复 p53 功能后对已有肿瘤的影响。研究结果表明,在 Eu-Myc 引起的淋巴瘤基础上,恢复 Trp53 活性可产生快速细胞凋亡,明显增加小鼠的存活率。另外,多西霉素(Doxycycline,Dox)调控基因表达的可逆诱导系统也被应用于 GEM 模型的建立,通过该系统诱导人 MYC 原癌基因的表达后,引起肿瘤的形成。随后观察在关闭 MYC 基因表达,导致原癌基因失活后,已形成的肿瘤的相应反应。该研究是应用 Dox 的 Tet-off 诱导系统,持续在小鼠造血干细胞中特异表达人 MYC 转基因,诱导小鼠形成恶性 T 细胞淋巴瘤和急性髓系白血病,在此基础上,如果通过添加 Dox 诱导剂使 MYC 表达停止后,发现已表现出的肿瘤表型也随之消弱,并证实此过程与肿瘤细胞周期死亡有关。研究也发现,对于此可逆诱导系统中停止激活 MYC 表达后的长期效果,不同的肿瘤类型是有区别。如在骨肉瘤中短暂抑制 MYC 表达,因肉瘤细胞分化为成熟的骨细胞的原因,所以会出现肉瘤持续的萎缩的现象。相反,虽然 MYC 表达抑制会引起肝癌出现弥漫性的萎缩,但是,存留的肿瘤细胞仍处于潜伏状态,并在重新开启 MYC 表达后,可以很快恢复其肿瘤特征。

3. 破解自发性转移形成机制

尽管有不断改善的肿瘤治疗选择策略,转移疾病仍然是引起癌症死亡的主要原因。转移过程是通过肿瘤细胞与肿瘤微环境相互持续作用而形成的复杂多步骤过程。过去绝大数临床前转移研究是借助细胞系接种模型来实施的,而这类模型不能真实反映肿瘤病人的转移过程。GEM 模型可引起原发肿瘤发展和转移形成,因而是研究过去未知的自发转移形成过程不可缺少的工具。由于原发肿瘤的过度生长的原因,在大范围转移形成之前,小鼠一般不得不被处死,这也是 GEM 模型潜在的不足之处。这一局限性可以通过将 GEM 来源的肿瘤组织进行原位移植方式解决,比如通过手术移植方式,达到保留供体肿瘤的肿瘤内异质性效果,使其转移过程的发生接近临床上常见转移疾病。

应用 GEM 模型研究肿瘤转移过程已获得了某些重要的发现。过去的研究认为肿瘤转移是发生在肿瘤形成过程晚期。然而,通过 BALB-NeuT 和 MMTV-PyMT 小鼠乳腺肿瘤模型的研究表明,来自早期损伤转染细胞已经具有传播至骨髓和肺组织而形成微小转移瘤。另外,上皮细胞至间叶细胞间的转移(EMT)被认为在肿瘤细胞传播和转移方面起到了非常重要的作用。然而,应用胰腺癌和乳腺癌 GEM 模型研究表明,肿瘤细胞不仅保留了其上皮细胞特征,却能在转移病灶位置出现,提示 EMT 在这些模型中的肿瘤转移形成并不是必须的。再有,在探索肿瘤转移形成过程中,肿瘤细胞与免疫系统之间复杂关联方面,GEM 模型明显发挥了突出关键作用。例如,骨髓免疫细胞,如巨噬细胞和中性粒细胞,在促进不同种癌症的转移形成方面,起到了至关重要的作用。最近有研究报道表明,乳腺肿瘤引起系统炎症状态,即由 IL17 - 产生的 T 细胞及继发的免疫抑制中性粒细胞的扩增,可引发小叶乳腺癌 GEM 模型的自发性转移形成,导致 GEM 移植模型的自发转移疾病。

GEM 模型在揭示相关基因参与抑制肿瘤转移机制方面也发挥了重要作用。最近,刘宝华课题组应用 Tet-ON 可诱导 Sirt7 表达的 GEM 模型,揭示了 Sirt7 抑制原发胰腺癌转移作用机制,该研究结果证实,由 Dox 诱导表达的 Sirt7 具有明显抑制 MMTV-PyMT 小鼠乳腺肿瘤肺转移的作用,且其作用机制是通过调节 TGF-β信号通路实现的。

因此,GEM 模型在揭示肿瘤转移复杂性,挑战当下普遍接受的关于肿瘤转移是由晚期癌症细胞包括 EMT 在内的转移过程理论等方面,都发挥了不可缺少的作用。这些重要发现有可能为转移癌症病人的治疗提供重要的参考依据。

4. 研究肿瘤微环境作用

在揭示肿瘤细胞外部因子如癌症相关成纤维细胞 (CAFs) 和免疫细胞与肿瘤形成过程等作用方面,GEM 模型已发挥了不可取代的作用。CAFs 可通过合成细胞外基质(ECM)成分(如胶原蛋白,纤维连接蛋白,层粘连蛋白)来调控 ECM 和基底膜形成。而且,CAFs 是各种可溶性介导物包括基体金属蛋白酶(MMPs) 来源, 达到促使 ECM 转化,加强其在维持 ECM 动态平衡方面的重要作用。GEM 模型研究已表明,CAFs 在肿瘤形成过程中具有双重作用。利用 K4-HPV6 鳞状皮肤癌小鼠模型研究发现,在上皮细胞恶性癌转化过程中,CAFs 能通过增强炎症,血管形成,以及 ECM 重新组成,达到刺激肿瘤的发展的作用。

相反,通过两个独立的胰腺癌 GEM 模型研究表明,在体内抑制 CAFs 具有加速肿瘤形成过程,提示 CAFs 对肿瘤的阻止作用。如此相互矛盾的现象对于免疫细胞则是可以理解的,起初免疫细胞被认为是可通过攻击转化的细胞,达到抑制肿瘤形成过程。然而,最近的研究表明,这些免疫细胞也具有促进肿瘤的功能。应用小鼠模型对一些不同的肿瘤类型的研究已揭示了炎症与肿瘤之间的相互关系。例如,应用大肠炎相关癌症的小鼠模型,在髓系免疫细胞中特异性敲除 NF-jB 信号系统后,降低小鼠肿瘤生长,表明其具有促进肿瘤作用。

另外,K4-HPV6 小鼠模型研究也表明,肥大细胞与骨髓来源细胞借助 MMP9 激活血管生成和重新调整基质结构等方式,发挥其促进鳞状皮肤癌形成作用。应用同样的皮肤癌症模型发现,慢性炎症有促进新生肿瘤形成的作用。至此,人们已经开始了对炎症诱导肿瘤相关巨噬细胞和中性粒细胞的促进作用进行研究。例如,在 MMTV-PyMT 乳腺癌小鼠模型基础上,将一种重要的巨噬细胞相关基因 CSF1 (Colony-stimulating factor1 )敲除后发现,该小鼠的乳腺肿瘤恶性化过程被延缓。同样,抑制 CXCR2(一种介导中性粒细胞迁移的趋化因子)则有抑制 APC 小鼠的肠道肿瘤形成的效果。总之,这些研究强调了免疫细胞在肿瘤发生与发展过程中,发挥了一起协同参与调控的作用。

5. 确定肿瘤细胞的来源

揭示肿瘤发生过程中的细胞来源将为开发与改善治疗策略提供非常重要的理论基础。应用 GEM 模型已经成功阐明了某些不同肿瘤类型的细胞起源。在小细胞肺癌(SCLC)研究中,通过气管内注射细胞特异性的 Adeno-Cre 病毒载体,使 Trp53 和 Rb1 两基因分别在 Clara 细胞, 神经内分泌的(NE)细胞,以及 II 型肺泡(SPC)细胞在被特异性敲除,分析肿瘤发生不同时间和肿瘤表型等。结果表明,相对于 SPC 细胞,NE 细胞是造成 SCLC 形成的细胞来源。另外,细胞来源的研究也能提供与以前研究结果不一样的意外结果。比如,过去以 BRCA1 为基础的乳腺癌研究认为,该类癌症的来源细胞是基底上皮干细胞。而应用 GEM 模型对 BRCA1 引起的基底样乳腺癌研究中发现,其实管腔祖细胞才是基底样肿瘤的真正来源。

最近来自两个不同实验的研究结果表明,遗传变异(如 Pik3ca 突变)可显著地影响干细胞库组成。Pik3ca 点突变(如 H047R)引起具有谱系特征的乳腺上皮细胞分化为多能干细胞样状态能力损失。而且,Pik3ca 乳腺肿瘤的细胞来源主导了其恶性程度,表明了在改善抗癌症药物及治疗效果的特异性方面,准确找到肿瘤细胞来源具有非常重要的实际意义。

6. 验证新药物靶点

考虑到不是所有的癌基因都是维持肿瘤形成必须的,因此,在针对相应靶点药物,开展人体临床试验前,即在临床前的动物体内,验证灭活 TSG,或者降低致癌基因是否能引起进行中肿瘤的萎缩成为非常重要的试验。应用可诱导小鼠模型可实现对致癌基因维持肿瘤相关性的验证,如在乳腺癌小鼠模型中,癌基因 Pik3ca 表达去诱导后,引起部分肿瘤的萎缩,提示这些肿瘤是 “依赖” 广泛性活性 P13K 信号密切相关的。然而,多数肿瘤最终因 Met 或 Myc 增加而复发,提示这些遗传损伤可能会诱导对 P13K 抑制剂的耐受性。此例子说明可诱导 GEM 模型应用于临床前研究,不仅可达到验证药物靶点的目的,而且对揭示药物耐受性的形成机制也具有其实际意义。

TSG 也有可能成为有效的药物靶点。由于 p53 基因的显性负作用或抑制突变,以及其特异性抑制剂 MDM2 和 MDM4 的增加 / 过表达等的原因,导致肿瘤中的 p53 功能丧失。应用可逆转抑制 p53 活性的 GEM 模型遗传学研究表明,重新恢复 p53 基因功能,可快速使已形成的肿瘤消退,提示研制针对抑制 MDM2 分子,从而恢复 p53 功能,或将突变型 p53 重新恢复为具有野生型功能 p53 的抗肿瘤药物临床意义。同样,应用可诱导敲低 APC 的 GEM 模型研究结直肠癌结果也表明,诱导恢复 APC 功能后,可迅速引起快速与广泛肿瘤细胞分化和持续的无复发萎缩,这为体内评价 APC/Wnt 通路作为 APC 突变引起的结直肠癌的治疗靶点提供了依据。

7. 阐明治疗效应与耐受

为了将临床试验中抗肿瘤新疗法失败的风险尽量降低到最低,建立临床前高效及预测性强的体内模型,客观评估相应药物效应及耐受性就显得更加重要。通过 Kras 突变引起的肺癌和胰腺癌的 GEM 模型研究发现,GEM 模型对靶向治疗和传统化疗的应答效应与相应病人的应答性具有非常大的相似性。需要加以关注的是小鼠与人在药物代谢方面却表现明显不同,比如,参与肝脏药物代谢的细胞色素 P450 酶底物特异性方面,不同的物种存在较大的差异。该类问题可借助人源化小鼠模型加以解决。因此,建立人源化的 GEM 模型作为临床前药物效果的研究,将有助于优化针对靶特异抗肿瘤药物的研发,以及寻找与确定治疗效应的关键因素,并使其成为肿瘤病人特征的预测性生物标记。另外,GEM 模型也可应用于探索治疗敏感性肿瘤获得性耐药的形成机制。

在探讨肿瘤治疗效应与耐受机制方面,K14cre; Brca1-f/f; Trp53-f/f (KB1P) 小鼠是作为 BRCA1 突变乳腺癌临床前 GEM 模型的一个非常有说服力的例子。KB1P 小鼠可形成完全模拟类人 BRCA1 突变乳腺癌组织病理学特征的乳腺肿瘤,而且,对含铂类药物和 PARP 抑制剂也具有高敏感性。临床试验证实,PARP 抑制剂 Olaparib 可以治疗卵巢肿癌,乳腺癌和结直肠癌。 虽然该药物并不对所有这类癌症病人治疗都有效果,但其对 BRCA1 突变携带者表现有明显治疗效果,这可能与 PARP 抑制剂合用引起的协同致死作用与 BRCA1 缺乏有关。BRCA1 突变细胞对 PARP 抑制剂表现为更加容易被损伤,因为 PARP 抑制剂诱发的单一链 DNA 断裂,可导致 DNA 复制时的双链断裂,造成 BRCA1 缺失细胞无法实施同源重组机制来修复损伤的 DNA。

根据 Olaparib 在临床试验中获得的理想效果,FDA 于 2014 年 12 月批准了该药用于 BRCA1/2 突变卵巢癌病人的治疗。尽管病人对该药物有很好的反应效果,然而,在病人和 GEM 模型研究中都发现了获得性药物耐受性。通过临床前 KB1P 小鼠模型研究证实,这类耐药机制与药物运输物及同源重组恢复等数量的增加有关。这些研究结果有助于了解临床上耐药性的产生, 以及设计针对 Olaparib 耐药病人的改进治疗策略。

关于肿瘤治疗效应与药物耐受性的关系,现在也是逐渐比较清楚,即其影响不仅受肿瘤细胞自身因素,而且与成纤维细胞和免疫细胞等基质因素有关。通过 PDAC 的 GEM 模型进行肿瘤干预研究结果表明,治疗是抑制旁泌性相关信号通路,降低促结缔组织增生肿瘤基质,增加肿瘤脉管系统,导致促进抗肿瘤药物导入肿瘤部位的过程。然而,关于攻击 PDAC 中肿瘤基质的概念,最近有来自两个研究对该理论进行了挑战。此两研究结果表明,基质因素可能通过阻止肿瘤血管形成,引起不是促进而是抑制 PDAC 生长。所以,这些研究都揭示了肿瘤微环境在治疗耐受性方面,发挥了比过去想象的更加重要的,且复杂的作用。

8. 肿瘤免疫治疗

在过去十年,通过对免疫反应的深刻揭示与认识,建立了利用病人免疫系统攻击肿瘤的治疗策略。近年来的黑色素瘤和肺癌临床病人试验已证实,包括抗 CTLA-4 和抗 PD-1 的免疫检查点抑制物,对增强病人有效抗肿瘤免疫及改善生存率等方面具有巨大潜力。这些临床试验基础是来自过去几十年在实验小鼠模型上开展的基础研究,从而揭示了 CTLA-4 和 PD-1 在阻止免疫反应中的重要性,特别是通过对 CTLA-4 和 PD-1 敲除小鼠出现严重与温和程度的自发性自身免疫表型的明确证实。应用 CTLA-4 抑制物引起接种肿瘤小鼠的抗肿瘤 T 细胞反应增加,产生肿瘤排斥作用,提示释放 T 细胞上的刹车可能是抵抗肿瘤的一个潜力的应对策略。尽管如此,同时也应该清楚的了解,仍有一定比例的病人对此类免疫治疗没有反应,且目前的挑战是还不知道其真正原因。

目前,虽然绝大部分的免疫学研究都是基于肿瘤移植小鼠模型的基础上进行的,但就现在研究情况预测表明,今后 GEM 模型应用于该领域的研究将会越来越增加。应用 GEM 模型研究的部分结果表明,在新形成的肿瘤过程中,因肿瘤引起的耐受机制,T 细胞丧失去其对肿瘤细胞的反应性,特别明显的是,如果将来自 GEM 模型小鼠形成的肿瘤细胞,接种至免疫缺陷小鼠体内,肿瘤会快速生长,而野生小鼠则能排斥这些肿瘤细胞。提示这些肿瘤细胞没有失去其免疫原性,T 细胞仍然能识别这些细胞并发挥其攻击作用。但在原发肿瘤小鼠的体内这些 T 细胞却无能为力。

肿瘤常常被认为是慢性炎症的结果,这种炎症可引起局部和系统免疫抑制,从而不利于 T 细胞发挥其有效的功能。而且,肿瘤常表现为树状突细胞(DC) 功能缺失,导致 T 细胞启动缺损。例如,在 MMTV-PyMT 乳腺肿瘤小鼠模型中发现,原本具有潜在激活抗肿瘤 T 细胞的 DC 细胞,会被大量存在的巨噬细胞竞争抑制,这些巨噬细胞起到了阻止特定 T 细胞激活的作用。最近的研究也证实,促进 DC 细胞功能或阻止骨髓细胞引起的免疫抑制,可以达到改善免疫检查点抑制物的抗肿瘤效果。因此,对肿瘤病人实施耐受 T 细胞免疫激活疗法的时候,结合应用针对改善免疫抑制或则增强 T 细胞启动的靶点药物,在临床上可能会起到更好的治疗效果。

相对于肿瘤接种模型,应用 GEM 模型进行免疫治疗研究需要不同的方法。考虑到 GEM 模型中肿瘤是在每个独立小鼠体内发生的,如同病人肿瘤的发生过程,具有特殊的肿瘤抗原。因而,具有其异质性的特点,从而确保区别鉴定反应和非反应肿瘤之间的分子不同,也有助于临床预测的生物标记物的建立。然而,对于大多数 GEM 模型来源的肿瘤,辨认可被 T 细胞识别的表达肿瘤抗原却是未知的。为了克服这点,可借助基因修饰的方式,将临床上相关肿瘤抗原引入小鼠体内,使其具有诱发肿瘤特异性 T 细胞反应的效果。比如,应用低免疫原性的肿瘤(如肉瘤和肺癌)将肿瘤特异性抗原引入至 GEM 模型后,这些肿瘤的免疫原性增加,引起潜在而短时间的抗肿瘤 T 细胞反应。起初的抗肿瘤 T 细胞反应很快发生,然后是可调控 T 细胞介导的免疫抑制。因此,这些模型将有助于目前与未来相关研究,以达到揭示免疫逃逸的复杂机制,最终研发具有改善的肿瘤免疫治疗的新策略。

9. 与临床试验并行的 GEM 模型

最近推出的 “与临床共试验” 范例,目的是将临床前 GEM 实验与人体临床试验同时开展,从而达到预测治疗效果的作用。该策略已经应用于前列腺癌治疗中,并成功揭示了由雄性激素诱发的耐受性是其中遗传关键因子,以及在克服去势难治性的新综合疗法。同样,应用 NSCLC 的 GEM 模型一起临床试验表明,Kras/Lkb1 突变肺癌较 Kras or Kras/p53 突变肿瘤对临床上的 Docetaxel 和 MEK 抑制剂 Selumetinib 的联合疗法,表现为更加具有耐受性。揭示了 LKB1 是临床试验中对此类药物联合疗法耐受潜在决定因素。这类研究表明,应用 GEM 模型作为人肿瘤临床前药物效果研究,能发现新的生物标记物和联合疗法,

GEM 在肿瘤学研究中发展趋势与未来展望

许多抗肿瘤药物在临床试验中未能达到临床前实验的期望目的,已经成为目前肿瘤学与转化癌症医学所面临的巨大挑战,如何改善肿瘤学领域的临床前研究结果的预测性,也是人们十分关注的热点。因此,如何选择更能真实反映人肿瘤疾病发生发展过程的临床前肿瘤动物模型,将显得更加重要了。为了实现这一目的,首先需要考虑的是如何建立能真实反映肿瘤本身及外在特征的临床前小鼠模型。比如,临床前模型应该含有病人特异性突变,该种突变具有诱发恶性肿瘤的趋势,且在一定病人群中显示遗传变化特征。另外,原发的肿瘤过程是在自然微环境中进行的,如同在人肿瘤进行过程中所见的肿瘤细胞与肿瘤微环境之间相互作用(包括免疫细胞,成纤维细胞,以及淋巴细胞和血管的潜入)。再有,由于绝大多数进入临床试验的病人已经是处于广泛肿瘤转移疾病过程中,因此,实验设计时就应该考虑选择能模拟病人疾病不同进程状态的小鼠模型,开展相应的临床前的药物效果评估研究。在现实的临床试验中,往往进入临床试验的病人之前多是经过不同程度的治疗,因而极有可能会干扰治疗效果的验证。而临床前的动物研究则是建立在从来没有接受如何治疗基础上进行的,从而导致高估治疗效果的结果。从另外一方面讲,临床试验中对那些接受过治疗的严重病人没有效果,却仍有可能对没有接受过治疗的严重病人有益处。

最近基因修饰模式动物技术的进展,促进了快速研制更加精准的能引起原发肿瘤的小鼠模型,该类模型结合了特异性肿瘤病人形成发生发展过程中肿瘤细胞本身和细胞外特征。预测这些新一代的 GEM 模型和基于 GEM 模型的移植模型,将是作为真实模拟病人肿瘤发生发展过程,研究自发性转移疾病最佳模式动物。这些模型可作为研究肿瘤形成的复杂过程(包括肿瘤的起始,器官特异性转移的形成,肿瘤微环境的参与等方面)的重要而有用工具。但是,对于肿瘤病人而言,更加重要的是,这些模型能更为深入揭示免疫治疗中反应性与耐受性,以及疾病的复发等相关机制。期待未来,应用新一代 GEM 模型对抗肿瘤新药物临床前的评估研究,将会增加预测其在临床试验中的成功率,从而加速设计抗肿瘤新药策略与临床实施,达到改善防治肿瘤病人的最终目的。


主要参考文献:

1. Li K, Wang F,Cao WB, and ZW et al (2017) TRIB3 Promotes APL Progression

through Stabilization of the Oncoprotein PML-RARa and Inhibition of p53-Mediated Senescence. Cancer Cell 31, 697–710

2. Tang X,Shi L,and Liu B et al (2017) SIRT7 antagonizes TGF-β signaling and inhib-its breast cancer metastasis. Nature Communications 8: 318

3. Liu C, Ren YF, Yi Lv and Xu-Feng Zhan et al (2017) Activation of SRY Accounts for Male-Specific Hepatocarcinogenesis: Implication in Gender Disparity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Letters 410: 20-31

4. Chunga WJ, Daemena A, Melissa R, and Junttila MR et al (2017) Kras mutant genetically engineered mouse models of human cancers are genomically heterogeneous. PNAS Dec 4, E10947–E10955

5. Annunziato S, Kas SM, Nethe M, and Drenth AP et al (2016) Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes Dev 30: 1470 – 1480

6. Drost R, Dhillon KK, and Schut E et al (2016) BRCA1185delAG tumors may acquire therapy resistance through expression of RING-less BRCA1. J Clin Invest 126: 2903 – 2918

7. Maresch R, Mueller S, and Barenboim M et al (2016) Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/ Cas9 delivery in mice. Nat Commun 7: 10770

8. Chiou SH, Winters IP, Wang J, and Chuang CH et al (2015) Pancreatic cancer model-ing using retrograde viral vector delivery and in vivo CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing. Genes Dev 29: 1576 – 1585

9. Weber J, Öllinger R, and Engleitner T et al (2015) CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci USA 112: 13982 – 13987

10. Dow LE, O’Rourke KP, and Lowe SW et al (2015b) Apc restoration promotes cellu-lar differentiation and reestablishes Crypt homeostasis in colorectal cancer. Cell 161:1539 – 1552

11. Henneman L, van Miltenburg MH, and Schlicker A et al (2015) Selective resistance to the PARP inhibitor olaparib in a mouse model for BRCA1-deficient metaplastic breast cancer. Proc Natl Acad Sci USA 112: 8409 – 8414

12. Clohessy JG, Pandolfi PP (2015) Mouse hospital and co-clinical trial project- from bench to bedside. Nat Rev Clin Oncol 12: 491 – 498

13. Cong L, Ran FA, Cox D, and Marraffini LA et al (2013) Multiplex genome engi-neering using CRISPR/Cas systems. Science 339: 819 – 823

14. Jamieson T, Clarke M, and Nibbs RJB et al (2012) Inhibition of CXCR2 profoundly suppresses inflammation-driven and spontaneous tumorigenesis. J Clin Invest 122: 3127 – 3144

15. Drake AC, Chen Q, Chen J (2012) Engineering humanized mice for improved hematopoietic reconstitution. Cell Mol Immunol 9: 215 – 224

16. Liu P, Cheng H, and Fox EA et al (2011) Oncogenic PIK3CA-driven mammary tu-mors frequently recur via PI3K pathway-dependent and PI3K pathway- independent mechanisms. Nat Med 17: 1116 – 1120

17. Martins CP, Brown-Swigart L, and Evan GI (2006) Modeling the therapeutic effica-cy of p53 restoration in tumors. Cell 127: 1323 – 1334

18. Shibata H, Toyama K, Shioya H, and Toyoshima K et al (1997) Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science 278: 120 – 123

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序