610A 采用 CytoFLEX 流式细胞仪上的紫光侧向散射光，有利于进行亚微颗粒分析和计数
贝克曼库尔特
背景和目标
基于 FCM 的纳米颗粒（SMP）检测需要特殊的散射光参数设置。该参数的设置和标准化可以用微球作为 QC 工具实现。
目标：采用流式细胞仪 (FCMr) 对 SMP 进行分析和计数。
● 采用微球对最有用的散射参数（FSC 或 SSC）进行测定
● 采用先前的标准化设置（1、2）对其标准化效果进行测试
● 对比蓝光和紫光 SSC 的散射灵敏度和分辨率
● 确认采用质控微球检测散射分辨率得到的增益值，是否会使检测细胞源微颗粒（MP ，亦称为 EV）具有较高灵敏度检测出现灵敏度增益值。
● 测试体积法绝对计数。
方法
质控微球：带荧光的大小校准过的聚苯乙烯珠混合物（1、2）。Mgx + FSC：100 nm – 300 nm – 500 nm – 900 nm 微球， 适用于以 FSC 触发检测微颗粒的 FCMr（例如，具有 W² 的 B.C.Gallios/Navios、Astrios、带 PMT-FSC 的 BD FACS-SORP、Influx）。
Mgx + SSC：160 nm – 200 nm – 240 nm - 500 nm 微 球，适用于以 SSC 触发检测微颗粒的 FCMr（其他荧光微球， 例如，B.D.FACS & LSR、Apogee A50、Stratedigm、MacsQuant、… 1）。
Gigamix = 两种 Mgx+ 的 v/v 混合物。其他荧光 75 nm 微球。
细胞源的微颗粒：无血小板血浆中的 PMP (CD41/AnnV)（正 常 供 体）；TF+ MP (SBTF1-PE/AnnV-F) & EPC-MP (CD59-PE/AnnV-F)，从 BxPC3 胰腺癌细胞和血管内皮祖细胞培养液中纯化并提取出来。
结果
1. CytoFLEX 采用 SSC 而非 FSC 标准化策略 (C & D vs G)
2. Violet SSC → 对微球 < 200 nm 和低背景噪声的分辨率率提高 (D)。vSSC 阈值较低，可以适用于低于 75 nm 的微球。（E、F）。
3. SSC 或 vSSC 使用阈值值为 170 nm 的 SSC 标准化设置 (G)，以及 FSC 使用阈值为 300 nm 的设置 (F) ，获得相似 PMP 计数。 CytoFLEX vSSC 截断值为 100 nm →PMP 计数值较高 (G)。
4. 降低 vSSC 阈值 → MP-TF 和 EPC-MP 计数高于实际标准（K、L）。
结论
1. Megamix-Plus 和 Gigamix 是非常有用的、评估新 FCMr 的质控工具。
2. 采用 CytoFLEX 时，可以通过 SSC 488 进行 SMP 分析， 但最佳方式是采用 SSC 405 (vSSC)。
3. VSSC 参数对 75nm 和 100nm 的微球分辨率很高。
4. 当 vSSC 阈值小于等于 100 nm 时，可对 MP 样品进行分析。
5. 较低 SSC 触发阈值 →更多 MP（参见各种类型）
采用体积法计数可以获取令人满意的数据（摘自摘要的新数据 #）
A) 散射光信号触发触发：FSC 或 SSC ？
采用两组 FCMr 进行 SMP 分析：有些使用 FSC 时表现最佳， 而其他一些则在使用 SSC 时分辨率更佳（有些则同时具备这两项优势，1）
相同 MP（例如，PMP 子集）位于 FSC 和 SSC 的不同位置。塑料微球是非常有用的质控工具，能够以可再现的方式设置 FCMr，但是无法提供 MP 的绝对大小信息（取决于折射率）。
B) SMP 仪器评估以及质控
1. 仪器是否在标准化条件下运行？
2. 哪一项为优选散射参数？
FSC 或 SSC ？→ 遵照右侧的组织结构图 (从 1 补充物料开始)。确认 FCMr 是否适合使用标准化条件后：
参考文献：
1.Poncelet P, Cytometry A, 2016 ; 89: 148-58.
2.Poncelet P, Transfusion & Apheresis Science, 2015, 53: 110-126.
C) 用蓝光对 CytoFLEX 进行初始质控
1. FITC 荧光信号触发触发 + Gigamix
2. → 蓝光 SSC 可以接受（非最佳）
3. → FSC 不可接受 (S.I. 500 –300 nm << 3.0)
4. 转至蓝光 SSC 触发，约 170 nm（标准）
5. 过滤后的水进样操作：约为 10,000 events/s，且可接受丢弃率约为 10%。
6. Violet-SSC → MP 分析灵敏度高于蓝色 SSC ？→
D) 用紫光对 CytoFLEX 进行二次质控
1. FITC 荧光信号触发触发 + Gigamix
2. → 紫光 SSC：300 nm 以下时，分辨率较高
3. 转至 vSSC 触发，约 170 nm（标准）
过滤后的水进样操作：< 10 events/s，丢弃率 < 1%。
E) CytoFLEX vSSC 可分辨 75 nm 微球
1. FITC 荧光通道信号触发触发 + Gigamix
2. 加入荧光 75 nm 微球
3. 75nm& 100 nm 微球间距较大
4. # 来自蓝光 SSC：75 nm ~ 100 nm。
5. 注意原始 1：数使用（B 从.C. Kaluza v1.5 重新处理获自 CytoFLEX
6. 注使意用 2：CytoFLEX 日常质控在 vSSC 设置中不适用！→ Gigamix 进行 SMP 应用的质控操作。
F) CytoFLEX vSSC → 触 发<75 nm-eq.
1. vSSC 触发 & Gigamix + 75nm µS
2. 阈值低于 75nm 微球
3. 使用 H2O 作为样本时可接受背景噪声最大。
4. 在 vSSC（峰值 < 75 nm）中的背景噪声事件率要比蓝光 SSC（峰值约为 100 nm）的低很多。
5. 75nm 与 100 nm 微球之间峰距宽 → 高分辨率。
6. 低于 170 nm 的标准化策略有待创建
G) 在 Gallios 上进行标准化 PMP 计数
1. vSSC 触发 & Gigamix + 75nm µS
2. 阈值低于 75nm 微球
3. 使用 H2O 作为样本时可接受背景噪声最大。
4. 在 vSSC（峰值 < 75 nm）中的背景噪声事件率要比蓝光 SSC（峰值约为 100 nm）的低很多。
5. 75nm 与 100 nm 微球之间峰距宽 → 高分辨率。
6. 低于 170 nm 的标准化策略有待创建
H) CytoFLEX 上是否存在标准化选项？
对血浆中的 PMP 进行标准化计数的策略。CytoFLEX，带 vSSC。
1. 分析 Gigamix 微球（FL1 触发）
2. vSSC 阈值设为 0.1 µm
3. 在各个水平创建 SSC & vSSC 门，例如，220（« 较大 PMP »）、170（标准）以及 100 nm（< 标准）。
4. 定位 MP- 计数微球
5. 运行已染色的 PFP (CD41-PE/AnnV-F) + 阴性对照品（未显示）
6. 对 PS+PMP 与 MP 计数微球进行计数
7. 标准 170 nm 阈值将提供在 SSC 和 vSSC 上提供相似 PMP 计数
8.→ 100 nm 处 PMP 计数大约 2 倍以上
I) CytoFLEX 与 Gallios：计数标准化
1. Gallios：FSC 使用阈值值为 300 nm 设置 (F)
2. CytoFLEX：vSSC 作为触发信号触发，并设置阈值在 170 nm 处 (G)
3. → 可对比的 PMP 计数值
I b) CytoFLEX，带自动采样器：试管 vs µP
1. CytoFLEX 可采用试管或微板 (µP) 两种采样方式→对比试管（橙色）与 µP（蓝色）中的 PMP 计数值
2. MP- 计数 (3µm) 与 CytoCount (5 µm) 对比
3. → 微板 PMP 计数值 > 试管计数值 (1 min)
4. → 运行 5 分钟后数值接近 (?)
J) 体积法与微球法计数
1. CytoFLEX 提供体积法计数功能→对比体积法与微球法计数之间的 PMP 计数值。
2. 采用相同血浆样品，用三种不同条件的 vSSC 阈值条件检测（100nm、160nm & 200 nm）。
3. → 在相同条件下，对比两种计数方法的 PMP 计数值。~K~Hp~M~Kp~M4._阈值较低时，PMP 计数值较高。
5.*) 从摘要获取新数据
K) vSSC 可检测更多 TF+ 肿瘤 MP
1. 采用 GigaX+ 微球设门。
2. 标准限值：500nm、220nm、170nm
3. 新 vSSC 限值：100 & Max (? < 100)
L) vSSC 可检测更多 EPC-MP
1. 采用 GigaX+ 微球设门。
2. 标准限值：500、220、170nm
3. 新 vSSC 限值：100 & Max (?< 100)
4. vSSC 阈值 (« Max »)
5. 复 制 SSC/vSSC 门
6. 应用于 MP 分析 (FL1xFL2)
