real-time PCR 常用探针和仪器

1． SYBR Green I：
一种DNA结合染料，能非特异性地与双链DNA结合，结合后发出荧光，价格便宜，但因无特异性，易受到非特异性扩增和引物二聚体地的影响，是定量结果不可靠。可用融解曲线分析区分特异性和非特异性扩增，引物的设计和反应条件的优化对消除非特异性荧光有很大帮助。
2． Taqman探针：
也称为水解寡核苷酸探针。该探针在5’端标记报告荧光基团，在3’端标记淬灭荧光基团，在探针完整时报告荧光基团发出的荧光被淬灭荧光基团吸收，因此没有荧光产生。在延伸阶段，由于DNA聚合酶具有5’－3’外切酶活性，5’端标记报告荧光基团被水解掉，远离淬灭荧光基团，于是产生荧光信号。Taqman探针的优点是可以利用多种荧光同时进行多重分析，这是SYBR等DNA结合荧光基团所不具备的优点。
3．分子信标（molecular beacons）：
为一发夹结构，环区与目的片段特异性互补，茎区的5’端和3’端分别标有荧光基团和淬灭基团。自由状态的分子信标呈发夹结构，荧光基团和淬灭基团紧密接触，能量以热的形式消除，不产生荧光。退火时，发夹结果打开，环区与目的片段特异性互补结合，荧光基团和淬灭基团分开，释放出荧光。分子信标优于Taqman探针之处是可以检测单个核苷酸的突变，适合于SNP分析和等位基因突变分析。缺点是设计比较困难，既要避免产生强的背景信号，又要避免茎部杂交过强，影响其与模板的退火，从而影响荧光的生成。
4．杂交探针：
是一种新型的荧光探针，由两条探针组成，一条在5’端标记荧光（3’端被封闭，以防止退火后的延伸），一条在3’端标记荧光，其中一个为受体荧光基团，另一个为供体荧光基团，供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团的激发光谱，自由状态时只能检测到供体荧光基团发出的荧光。退火时两条探针与目的基因特异性结合，形成首尾连接，两个荧光基团互相靠近，供体基团发出的能量激发受体基团发出荧光，检测时只检测受体基团发出的荧光。只有当两条探针均与目的基因特异性结合时，才能检测到受体基团发出的荧光，因此检测的特异性大大增加。
5．Scorpion引物/探针：
由一条发夹结构的探针和一条引物构成，探针的5’端和3’端分别标有报告荧光和淬灭荧光，3’端通过一个非扩增的单体（防止探针退火后的延伸）与引物的5’端相连。在自由状态，报告荧光和淬灭荧光很接近，不产生荧光。变性阶段茎环结构打开，退火时引物与模板结合并延伸，环区与新合成的目的基因的互补区域结合，此时Scorpion探针与PCR产物在同一条DNA链上，是分子内的结合。由于发夹结构打开，报告荧光和淬灭荧光分离，因此可检测到报告荧光发出的荧光信号。由于Scorpion引物/探针中序列特异性引物和探针在同一分子上，因此信号的产生特别快。

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