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上篇
PCR的基本理论与技术

第一章 聚合酶链式反应
分子克隆(molecular cloning)、DNA测序(DNA sequencing)和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是当今现代分子生物学的三大主流技术。在这三种技术中，PCR技术在实践中的应用日益广泛并随着分子生物学实验技术的成熟而不断的创新和拓展。早在二十世纪七十年代初期H.Ghobind Khorana和他的同事就提出了用PCR技术以减少基因的化学合成中的工作量的想法。然而由于当时技术条件的限制，基因测序、引物合成等方面的研究都存在一定的局限性，特别是还没有发现稳定的耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase)等诸多因素，使得Khorana的想法在当时看来还不可能实现，并且很快就被人们所遗忘。然而，随着耐热DNA聚合酶的发现，十五年后美国PE.Cetus公司的Kary Mullis和他的同事通过使用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段成功的在体外扩增了哺乳动物的基因(Saiki等，1985；Mullis等，1986；Mullis和Faloona，1987)，从而实现了Khorana的设想，并将这一技术命名为聚合酶链式反应(PCR)。随着从耐热菌Termus aquaticus中提纯的耐热DNA聚合酶的发现和应用(Saiki等，1988)，大大的提高了PCR的效率并推动了其向PCR自动化技术的发展。此后，通过PCR技术，人们能在数小时内通过试管中的反应将特定的DNA片断扩增数百万倍。PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，为医学、遗传学和考古学等学科的研究提供了新的技术手段。目前，与PCR相关的技术已经不断的被开发应用。
第一节 PCR技术的原理
聚合酶链式反应(PCR)是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过试管中进行的DNA复制反应使极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍。其反应原理与分子克隆技术的细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要简单的多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3’末端互补的合成引物、4种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。
与细胞内的DNA复制相似，PCR反应也是一个重复地进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链的过程，这些过程都是通过控制反应体系的温度来实现的。PCR包含下列三步反应：

① 变性(denaturation)：将反应体系混合物加热到95℃，维持较短的时间(大约15~30秒)，使目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应的模板。
OptionsEmail RepliesDisable J② 退火(annealing)：将反应体系冷却至特定的温度(引物的Tm值左右或以下)，引物与DNA模板的互补区域结合，形成模板?引物复合物。必须精确的计算退火的温度以保证引物只与模板相对应的序列结合。由于模板链分子较引物复杂的多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，因此DNA模板单链之间互补结合的机会很少。
③ 延伸(elongation)：将反应体系的温度提高到72℃并维持一段时间，引物在耐热DNA聚合酶的作用下，以引物为固定起点，通过复制单链模板DNA沿5’→3’方向延伸，合成新的DNA链。因此，在这一阶段的末期，两条单链模板DNA又形成了新的双链，且双链中的新生DNA单链具有各种不同的延伸长度。
以上三步作为一个循环重复的进行，每一循环的产物作为下一循环的模板。因此，在第二轮循环中通过变性产生的4条DNA单链结合引物并延伸(如图1-1)，在第三轮及更多的循环中重复进行变性、退火、延伸这三步反应。如此循环20次，原始DNA将扩增约106倍，而循环30次后将达109倍。而所有上述过程将在1~2小时内完成。经过扩增后的DNA产物大多为介于引物与原始DNA相结合的位点之间的片断，而在反应前几轮循环产生的超过引物结合位点的较长链的DNA的比例将随着循环的不断地进行稀释到可以忽略的程度。
第二节 PCR反应体系
PCR的基本反应体系包括需要扩增的模板(template)、一对寡核苷酸引物(primers)、维持pH值的反应缓冲系统(buffer system)、一价或二价阳离子(monovalent or divalent cations)、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)、催化依赖模板的DNA合成的耐热DNA聚合酶(thermostable DNA)以及PCR促进剂等。
一、 模板(template)
PCR反应的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，先经过逆转录生成cDNA然后再进行PCR反应。PCR反应体系中，对模板的要求如下：
(一) 纯化的模板
DNA模板的来源广泛(可以从纯培养的细胞或微生物中提取，也可以从临床组织标本、犯罪现场标本、病理标本和考古标本中提取)，无论来源如何，待扩增的核酸模板都需要经过纯化处理以除去DNA聚合酶抑制剂。
(二) 模板的形式
含有目标靶序列的模板DNA可以通过单链或双链的形式加入PCR反应体系中。
(三) 线性DNA
由于环状DNA复性太快使其扩增效率略低于线性DNA，故常用线性DNA分子。若模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。
(四) 小片段模板DNA
尽管PCR对模板大小的要求不是十分严格，但是通常小片段模板DNA的扩增效率要高于大分子。因此，建议在PCR反应前使用机械剪切或者限制性内切酶消化基因组DNA以提高产量。
(五) 适宜的模板量
理论上PCR反应的最佳工作条件需要目标靶序列的单一拷贝作为模板，然而实际工作中常常在反应体系中存在数千拷贝的目标DNA。在哺乳动物基因组，通常每次PCR最多取1?g的基因组DNA作为模板，而这已含有多达3×105常染色体基因的拷贝。而对于简单得多的酵母、细菌及质粒基因组，每次反应的模板最大加入量分别为10ng，1ng和1pg。
二、 引物 (primers)
PCR扩增产物的大小以及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的，因此，引物的选择与序列关系到PCR的特异性。
(一) 引物的质量
一旦确定引物的序列，就可以用核苷酸合成仪合成引物。由于合成的引物中可能含有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整序列和脱嘌呤产物以及可以检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可以导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR反应所用的引物必须是高质量的引物，且需要纯化。通常可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法、离子交换法、高效液相层析法或寡聚核苷酸纯化柱法纯化。然而，使用自动DNA合成仪合成的寡聚核苷酸引物通常可以直接用于标准 PCR而不需要纯化。引物不使用时应在-20℃保存。在-20℃下，冻干引物至少可以保存12~24个月，液体状态则可以保存6个月。
(二) 引物的设计原则
在影响扩增反应的各种因素中，寡聚核苷酸引物的设计最为重要。为了抑制不需要的序列的扩增而获得大量的预期的产物，我们需要精心的设计引物。
当需要同时扩增靶DNA上的许多片段，即多重PCR(multiplex PCR)时，需要在反应体系中加入一对以上的引物。
PCR反应中有两种引物，即5’端引物和3’端引物。在扩增基因片段或cDNA片段时，通常以信息链为基准，5’端引物与位于待增片段5’端上游的一小段DNA序列相同，引导信息链的合成；3’端引物与位于待增片段3’端的一小段序列互补，引导互补链的合成，PCR反应的扩增产物就是这一对引物之间的双链DNA片段。
不同的PCR反应体系，由于模板的组成、待增片段的长度及其使用目的的不同，对引物的要求也不相同。引物设计的基本原则是最大限度的提高扩增效率和特异性，同时尽可能地抑制非特异扩增。引物设计的基本要求如下：
1. 引物的长度：设计引物的目的是要提高PCR的特异性。因此，这就要求引物与模板DNA中的靶序列以较稳定的形式互补结合。寡聚核苷酸的长度越长，获得的特定靶序列的特异性就越好，引物过短则会影响PCR的特异性。然而，引物过长会使延伸温度超过耐热DNA聚合酶的最适温度，也会影响产物的特异性。因此，引物的长度应适宜，一般要求18~25bp，一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。
2. 基本成分：G+C的含量一般为40%~60%。四种碱基应随机的分布，避免碱基堆积的现象。尤其引物的3’端，不应有连续的3个G或C，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。
3．引物自身：引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp的自身互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构，将影响引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。
4. 引物之间：引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。由于PCR反应体系中含有高浓度的引物，即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会使引物相互杂交，最终得到引物二聚体的扩增产物。若引物二聚体在PCR反应的早期形成，它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。通过精心设计引物、应用热启动PCR(hot start PCR)或者降落PCR(touch down PCR)及特制的DNA聚合酶，可以减少引物二聚体的生成。
5. 3’末端：引物的3’端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对。四种碱基引起的错配有一定的规律，以引物3’端A的影响最大；另外，引物3’末端碱基错配时，不同碱基的引发率存在很大差异，当末位碱基为A时，错配的引发率大大降低，而当末位碱基为T时，错配的情况下也能引发链的合成。因此，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。
6. 5’末端：引物的5’端并无严格的限制，在与模板结合的引物的长度足够的前提下，其5’端碱基可不与模板DNA互补而成游离状态。通常这些序列对寡聚核苷酸引物与模板的结合的影响并不显著。因此，引物的5’端可以被修饰，如附加限制酶酶切位点、引入突变位点、标记生物素、荧光物质、地高辛等，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。在后续的扩增循环中，这些与模板未配对的序列将被带到PCR产物的双链中，故在其PCR产物中，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。
7. 溶解温度：3’端引物和5’端引物应有相似的Tm值，其差别不应大于5℃。扩增产物与引物的Tm值的差别应小于10℃，以确保PCR循环中的扩增产物有效的变性。
8. 引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源。
9．引物的简并性：引物的3’端应为保守的氨基酸序列，即采用简并密码较少的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于引物的3’端。
引物的设计要考虑多方面的综合因素，依据实际情况具体分析，应尽量遵循上述原则。现在有许多设计引物的计算机软件，能综合分析优化组合引物的各种参数，对引物设计具有指导作用。
(三) 引物的用量及其计算
在PCR反应体系中，引物的浓度一般要求在0.1~0.5?M之间，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。引物浓度过低，则产物量低；引物浓度过高则会促进引物二聚体的形成以及非特异性产物的形成。非特异性产物和引物二聚体都可以作为PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP底物，从而抑制靶序列的扩增。
引物浓度的计算可按下面的方法进行：摩尔猝灭系数(EM)是1cm光程比色杯中测定1mol/L寡核苷酸溶液在UV260nm下的光密度(OD)值。EM可按下式计算：
EM=a(16000)+b(12000)+c(7000)+d(9600)
其中，a、b、c和d分别代表寡核苷酸引物中的A、G、C和T的个数。
例如：一纯化的24bp寡核苷酸溶于0.1ml水中，取10μl稀释至1ml，测其OD=0.76，原液OD为0.76×100=76，若此寡核苷酸的碱基组成为A=G=C=T=6，其EM=6×16000+6×12000+6×7000＋6×9600=267600，故原液中的寡核苷酸浓度为76÷267600=3.4×10-4mol/L=340nmol/L。
三、 反应缓冲系统(reaction buffer system)
反应缓冲系统提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。目前最常用的缓冲液是10~50mmol/L的Tris-HCl (pH8.3~8.8，20℃)，在72℃(通常PCR反应延长阶段的温度)时，其pH值为7.2左右，故在实际的PCR反应体系中，其pH值变化于6.8~7.8之间。
反应缓冲系统中还含有KCl，50mM以内的KCl有利于引物的退火，而50mM以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。然而，也有人认为含有50mM KCl的缓冲系统有利于大于500bp的DNA片段的扩增，然而将缓冲系统中的KCl浓度提高到70~100mM则有利于提高较小的DNA片段的扩增产量。
此外还可以向反应缓冲系统中加入Taq酶保护剂，如小牛血清白蛋白(100?g/ml)、明胶(0.01%)、Tween-20(0.05%~0.1%)或二硫基苏糖醇(DTT，5mmol/L)等。
四、 二价阳离子(divalent)——Mg2+
所有耐热的DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子(通常是Mg2+)。虽然使用含有Mn2+的缓冲溶液也可以使一些聚合酶具有催化活性，但其效率要比加入Mg2+低得多；而Ca2+则不能活化DNA聚合酶。因此，PCR反应中耐热DNA聚合酶的活性与反应体系中游离Mg2+浓度直接相关。反应体系中Mg2+浓度低时，酶的活力显著降低；过高时，酶则催化非特异性扩增。此外，Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。值得注意的是，由于PCR反应体系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低Mg2+的实际浓度，因此Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2~2.5mmol/L。如果可能的话，制备DNA模板时尽量不要引入大剂量的螯合剂(如EDTA)或负离子(如PO43-)，因为它们会影响Mg2+的浓度。
五、 三磷酸脱氧核苷酸(deoxynucleotide triphosphates,dNTPs)
四种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)为PCR反应的合成原料。在标准的PCR反应中各种dNTP的浓度应相等，若任何一种浓度明显不同于其它几种时，会诱发聚合酶的错误掺入从而降低链合成的速度。dNTP的浓度直接影响到PCR反应的速度和特异性，因此应严格的控制PCR反应体系中dNTP的浓度，具体要求详见第四节。
许多厂商出售专门用于PCR的dNTP储存液。这种储存液具有较强的酸性而不含焦磷酸盐，其目的是保护dNTP在储存液的冷冻和加热期间受到破坏。因此在使用前应用NaOH将pH值调至7.0~7.5。无论是自配的还是购买的dNTPs溶液在储存前都应分成较小的几份，然后在-20℃下储存，经过两次冷冻-加热循环后储存液就必须丢弃。若长期在-20℃下冻存，储存液中的少量的水分会蒸发而后凝结在储存容器上，因此储存dNTP液的容器在加热后应在微型离心机中离心数十秒以减少dNTP浓度的变化。
六、 耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase)
1983年美国PE Cetus公司的Kary Mullis使用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段首先建立了PCR技术，其延伸温度为37℃，然而由于Klenow片段在95℃的DNA变性温度下完全失活，因此在每轮循环步骤之后都需要再添新酶，操作十分繁琐，并导致反应体系中形成快速沉积变性的酶蛋白。此外，由于Klenow片段聚合反应温度偏低，引物与模板的非特异性结合增加，导致非特异性产物增多；同时，由于受到某些DNA二级结构的影响，聚合反应不完全，得不到完整的PCR扩增产物。直到1987年，发现了热稳定的Taq DNA聚合酶(Taq pol)等耐热的DNA聚合酶后，才使PCR技术有了重大的发展并逐步实现了自动化。
耐热DNA聚合酶能经受95℃以上的高温而不失活，因而无需在每轮循环中添加新酶；同时它催化的聚合反应的最适温度为70~80℃，此时引物与模板结合的特异性好，故产物的纯度高。现在已发现多种耐热DNA聚合酶，其共同特点是在高温下仍保持一定的酶活性，但各耐热DNA聚合酶的性能尚有一定的差别。目前在PCR反应中应用最多的是Taq pol。
(一) Taq DNA聚合酶
天然的Taq pol是从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1菌株中分离获得的。该菌株在1969年就从美国黄石国家公园的温泉中分离出来，能在70~75℃生长。现已克隆出该酶的基因，全长2499个碱基，编码分子量为94kD、长度为832个氨基酸的蛋白质。现将Taq pol的特点叙述如下：
1. 高热稳定性：Taq pol在92.5℃、95℃、97.5℃的半衰期分别为130min、40min和5~6min。在PCR反应中DNA变性时间通常为30~60s，若总共进行30轮循环累计热变性时间为15~30min，此时该酶仍然保持相当高的活性，完全可以保证PCR反应的需要。
2. 高催化活性：在已发现的耐热DNA聚合酶中，Taq pol的活性最高，达200,000U/mg。实验证明Taq pol的活性有明显的温度依赖性，Taq pol催化DNA合成的最适温度为75-80℃，此时延伸速率达150~300个核苷酸/秒/酶分子；70℃时为60个核苷酸/秒/酶分子；55℃时为22个核苷酸/秒/酶分子；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒/酶分子。当温度超过80℃时，几乎没有DNA的合成，可能与高温下引物和模板结合的稳定性遭到破坏有关。
3. 忠实性：序列分析表明Taq pol与Ecoli pol I N端区域(此区域与该酶具有5’→3’外切酶活性有关)高度同源，因此Taq pol亦有5’→3’端的外切酶活性。然而由于Taq pol没有E coli pol I的3’→5’外切酶活性区的同源序列，故Taq pol无3’→5’外切酶活性。因此，Taq pol不具有Klenow酶的校对功能，在其催化的PCR扩增过程中引起碱基错配的机率大大增加。通常，Taq pol在PCR反应出现碱基错配的机率为1/300~1/18000，在经过25轮扩增后，扩增产物的序列中每400个碱基就有一个与原始序列不同。
4. 逆转录活性： Mg2+在2~3mmol/L的浓度下，68℃时使该酶出现类似逆转录酶的活性。若有Mn2+存在时，其逆转录活性更佳。有报道，若反应体系中没有Mn2+，则不能进行150~250个核苷酸以上核酸的逆转录反应。利用这一特性，可以直接用于RT-PCR，尤其是短片段的扩增。
5. 非模板依赖的聚合活性：Taq pol具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的活性，可在新合成的双链产物的3’端加上一个非模板依赖的碱基。在四种dNTP中，该酶对dATP的聚合能力最高。所以，在标准PCR反应条件下，PCR产物的3’端的非模板依赖的碱基几乎总是A。利用这一特性，我们可以构建dT-载体来克隆带dA尾的产物。用Klenow酶可以将3’端的非模板依赖的聚合碱基去掉，即在PCR反应后，先加热至99℃10min灭活Taq pol，然后调整Mg2+浓度至5~10mmol/L，加入1~2U大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段，室温下作用15~20min。
(二) 其它耐热DNA聚合酶
目前已经发现了多种耐热DNA聚合酶，并对它们的特性进行了研究，同时人们还致力于对现有的耐热DNA聚合酶的修饰改造，以获得更好的性能，从而提高PCR的产量和质量。目前，主要有从嗜热栖热菌(T. thermophilus)中分离的Th DNA聚合酶、从litoralis栖热球菌(T. litoralis)中分离的Vent DNA聚合酶、从酶热硫化裂片菌中分离出的Sac DNA聚合酶以及修饰Taq DNA聚合酶等。现将其特点分述如下：
1. 修饰Taq DNA聚合酶：常见的有重组Taq pol(rTaq pol.)和Stoffel片段。重组Taq pol为Letus公司利用基因工程在大肠杆菌中表达的Taq pol，其热稳定性比天然Taq pol要好，97.5℃时的半衰期达10min，此外Taq pol的热稳定性还与KCl的浓度有关，KCl的浓度分别为50mmol/L、25 mmol/L和10 mmol/L时，97.5℃保温10min后，Taq pol的活性分别下降50%、70%和80%。Stoffel等人首先通过除去Taq pol N端的289个核苷酸得到一种无5’→3’外切酶活性的61000的酶蛋白，故将其称为Stoffel片段。Stoffel片段的热稳定性极佳，97.5℃的半衰期达到了20min，比Taq pol延长了两倍多，利用此酶可以提高PCR反应中的变性温度，这对于扩增GC丰富的模板及具有二级结构的模板极为有利。同时由于Stoffel片段的Mg2+浓度作用范围增大为2~10mmol/L，故运用Stoffel片段可以改善复合PCR的反应结果。
2. Th DNA聚合酶：该酶从嗜热栖热菌(T. thermophilus)中分离得到，在高温和MnCl2存在的条件下，能有效的转录RNA。当螯合了Mn2+后再加入Mg2+，则可以使该酶的聚合活性增加，因此cDNA的合成与扩增可以用同一种酶催化。此外该酶对抑制Taq pol的血液成份的耐受力较强。
3. Vent DNA聚合酶：New England Biolabs公司从海底火山口 98℃水中生长的Litoralis栖热球菌中分离提纯得到Vent DNA聚合酶，并在大肠杆菌中成功的表达了该酶。此酶的热稳定性极好，97.5℃下的半衰期长达130min。此外Vent DNA聚合酶还具有3’→5’外切酶的活性，因此在催化DNA合成时具有校正功能，从而有效的降低碱基错误掺入率，提高扩增的忠实性。其碱基错误掺入率为1/31000，扩增产物的忠实性比Taq pol提高5~10倍。
4. Sac DNA聚合酶：该酶是从酶热硫化裂片菌中分离纯化得到的，其Mg2+的浓度作用范围较大，为2~8mmol/L，故有利于复合PCR反应的进行。此外，Sac DNA聚合酶也可用于DNA测序，但测序中ddNTP/dNTP的比率要高。此外，该酶还可以用于基因的定点融合等。
5. Pfu DNA聚合酶：Pfu DNA聚合酶是从Pyrococcus furisus菌体中提纯的，该酶具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切酶活性，故此酶具有校正功能，其催化DNA合成的忠实性要比Taq pol高12倍。此外，Pfu DNA聚合酶的耐热性极好，97.5℃的半衰期大于3小时。由于在无dNTP存在时Pfu DNA聚合酶会降解模板DNA，故在反应时此酶一定要最后加到反应体系中。然而，由于该酶采用低盐缓冲溶液(20mmol/L Tris-HCl，pH 8.2，10 mmol/L KCl，6mmol/L (NH4)2SO4，1.5mmol/L MgCl2，0.1% Triton x-100，10ng/ul BSA)，故退火温度较低，在37℃~45℃之间。
我国的PCR技术发展和应用十分迅速，现在复旦大学、中国医科院、华美公司均能生产耐热DNA聚合酶，耐热DNA聚合酶的国产化对推动我国PCR技术的发展、普及起着极其积极的作用。
七、 PCR促进剂
据报道通过向PCR反应体系中加入助溶剂和添加剂，可以降低碱基错配水平，提高富含GC模板的扩增效率。助溶剂包括甲酰胺(formamide)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和甘油(glycerol)；添加剂包括氯化四甲基铵(tetramethylammonium chloride，TMAC)、谷氨酸钾(potassium glutamate)、硫酸铵(ammonium sulfate)、离子化及非离子化的除垢剂等。目前关于PCR反应促进剂对扩增效率的影响机制尚不清楚，可能是添加剂消除了引物和模板的二级结构，降低了DNA的解链温度使双链DNA变性完全。同时PCR反应促进剂还增进DNA复性时的特异性配对，增加或改变DNA聚合酶的稳定性等，提高PCR的扩增效率。下面介绍一下几种常见的PCR促进剂：
(一) DMSO
反应体系中加入5~10%的DMSO有利于DNA的变性。使用DMSO对大肠杆菌的DNA聚合酶的Klenow片段是有益的，但是对Taq DNA聚合酶具有抑制作用。
(二) 甘油
反应体系中加入5%~20%的甘油有利于DNA的复性，尤其是对富含G+C的二级结构以及长片段的靶序列的扩增更适用，但需要注意甘油并非对所有的PCR都有益。
(三) TMAC
在反应体系中加入1×10-4~1×10-5mol/L的TMAC可以去除非特异扩增，不抑制Taq DNA聚合酶活性，促进PCR。
大多数PCR促进剂在浓度较高时对PCR反应起抑制作用，故在实验中应根据具体的情况选用适当浓度的PCR促进剂。
第三节 PCR的反应温度和循环参数
PCR反应是一个重复的循环过程，每一循环包括三个阶段的反应，加热而导致模板的变性，变性后寡聚核苷酸引物和与它互补的单链靶序列杂交而退火以及由热稳定DNA聚合酶的介导使已杂交的引物的延伸。
一、 变性温度与时间
在PCR反应中，能否成功的使模板DNA和PCR产物变性是反应成败的关键。只有当模板DNA和PCR反应产物完全变性成为单链后，引物才能在退火过程中与模板结合。变性通过加热来实现。变性所需的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中的G+C含量。双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA，从而导致PCR的失败。
二、 退火的温度与时间
退火的温度决定着PCR反应的特异性。引物与模板复性所需的退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。引物长度越短、G+C的比率越低，所需的退火温度就越低。一般来说，降低退火温度可提高扩增产量，但引物与模板间错配现象会增多，导致非特异性扩增上升；若提高退火温度可减少引物与模板间的非特异性结合从而提高反应的特异性，但扩增效率下降。退火温度确定后，退火的时间并不是关键性的因素，但也应加以控制。退火时间过短，会导致延伸失败；而退火时间太长会增加引物与模板间的非特异性结合。
三、 延伸温度与时间
延伸的温度取决于所使用的DNA聚合酶的最适温度，一般延伸的温度设定在所用的DNA聚合酶的最适温度附近以获得最大的扩增效率。不合适的延伸温度不仅影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。延伸的时间视待扩增DNA片段的长度而定。在最适温度下，核苷酸的掺入率为35~100个核苷酸/秒，故延伸1min对于2kb的扩增片段已经足够，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。
四、 循环次数
循环次数决定着扩增的程度。在其它参数都已优化的前提下，循环次数取决于最初靶分子的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量及碱基错配数，此外还会导致PCR反应“平台效应”的出现；循环数太少会影响正常的PCR产物量。
第四节 PCR反应条件的优化
特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。PCR的高特异性是指PCR反应只产生预期的靶序列。PCR的有效性是指经过相对较少的PCR循环能获得更多的产物。而PCR的忠实性则是指PCR反应的精确性，其产物中几乎没有由DNA聚合酶诱导的碱基错配。理想的PCR反应应该体现高度特异、高效和忠实。研究表明这三个参数都受到PCR反应体系中的众多成分及反应参数的影响，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性、高产量的条件并不一致。因此，我们在建立PCR反应时，必须明确哪一个参数对于预期的扩增是最为重要的，并据此优化反应条件。本节将讨论如何根据预期的指标优化PCR反应体系的各参数以及如何评价PCR反应的忠实性。
一、 PCR反应条件的选择
(一) PCR反应体系成分
1. 模板核酸：模板核酸可以为多种形式的DNA，但是必须预先纯化以除去蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增最好只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板，但其PCR产量较低。实验表明，在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。为了获得较高的产量同时保证较高的反应特异性，通常PCR反应的模板加入量为102~105拷贝的靶序列。需要指出的是，扩增相同拷贝数的靶序列时，向PCR反应体系中加入的含靶序列的模板核酸的量是不同的。例如，3×105单拷贝的靶分子相当于1?g人基因组DNA、10g酵母DNA和1ng大肠杆菌DNA，而1% M13噬菌体相当于106靶分子。
以质粒DNA和以染色体DNA为模板时的扩增最适条件是不同的。前者在PCR反应中所需要的酶量少，循环数少，温度也不如染色体DNA要求严格。
扩增靶序列的长度根据不同的目的而不同。例如，用于检测目的基因的扩增片断长度一般在500bp以内，一般100~300bp为最佳，然而，在适当的条件下，例如使用较长的延伸时间，可扩增长达10~20kb的片段。
2. 引物：PCR反应所需的引物质量要高，且需纯化，否则引物中相当数量的“错误序列”将导致非特异性扩增和信号强度降低。 通常引物设计应与模板精确互补，然而少数情况下在另外一些扩增中，如等位基因PCR、突变工程或在基因组的特定区引入新的限制性内切酶核酸酶切位点以及序列不清楚地同源基因的克隆，需要有目的的或是不可避免的引入错配碱基。由于引物与模板的结合不可能是完全特异性的，为了减少引物与模板的非特异性结合、提高PCR的特异性，引物序列应该从基因的内含子区域选择。引物的设计要遵循一定的原则，具体可参见第二节。PCR反应体系中引物的浓度一般为0.1~0.5?mol/L，在此范围内，PCR的产物量基本相同。若引物量过低会导致PCR产物量降低，而如果引物量过高，则会引起碱基错配和非特异性的扩增、生成引物二聚体，从而使目的DNA片段的扩增量下降。通常引物应当10倍量于靶序列。此外，引物的Tm值与退火温度相关，故引物的Tm最好在55℃~80℃的范围，以接近72℃为最佳。
3. 反应缓冲系统：目前最为常用的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液。通常在缓冲液中加入50mmol/L以内的KCl以利于引物的退火，高于此浓度的KCl或NaCl会抑制Taq pol的活性，在有些缓冲系统中可以用16.6mmol/L的NH4+代替K+。此外还可向反应体系中加入小牛血清白蛋白(100?g/L)或明胶(0.01%)或Tween-20(0.05~0.1%)或二硫基苏糖醇(DDT，5mmol/L)等以保护Taq pol。尽管上述缓冲液适用于大多数的模板和寡核苷酸引物，但对于特定PCR的最佳缓冲条件还是随着模板、引物及反应液中其他成分的不同而不同。因此这里所谓的标准缓冲条件只能作为探索进一步的改进PCR反应体系的基础。
4. 二价阳离子(Mg2+)：耐热DNA聚合酶的活性依赖于反应体系中的二价阳离子。已经表明，对于提高耐热DNA聚合酶的活性，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+则无效。研究表明，若反应体系中Mg2+浓度过低会显著降低酶的活性，而Mg2+浓度过高时又使酶催化非特异性扩增增强。此外Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物解链的温度，从而影响扩增片段的产率。由于在PCR反应体系中的模板DNA、dNTP、引物中的磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低反应体系中的游离Mg2+的浓度，而耐热DNA聚合酶需要的是游离的Mg2+，因此一般Mg2+的加入量应比dNTP的总浓度高0.2~2.5mmol/L。在不同的反应体系中模板DNA、引物以及dNTP的量各不相同，因此应根据具体的情况来确定特定PCR反应体系中的Mg2+的最适浓度。例如，虽然通常使用的Mg2+浓度为1.5mmol/L，然而也有报道使用高达4.5 mmol/L或6 mmol/L的Mg2+以降低某些情况下的非特异性的扩增。现在很多公司(例如Invitrogen、Peikin-Elmer和Stratagence)出售缓冲系统优化工具包，这些工具包含有各种各样的缓冲系统组合以方便实验者能迅速的找出对于特定的模板核酸和引物组合的最佳缓冲系统。此外我们还可以用下面的方法优化Mg2+浓度。在确定模板DNA的量、引物、dNTP的浓度以及PCR的循环参数的前提下，从10mmol/L的Mg2+储存液中，将Mg2+的加入量以0.5mmol/L递增，逐一加入10支反应管中，即每支反应管中的Mg2+浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5~5.0mmol/L。根据比较这10支含有不同浓度的Mg2+的反应管的PCR产物的产量，来确定反应体系所需的Mg2+浓度。有时，还可在此基础上，在初步选定的Mg2+浓度范围上下进一步缩小Mg2+浓度范围以0.2mmol/L递增，进一步筛选以获得最佳Mg2+浓度。
5. 三磷酸脱氧核苷酸：PCR反应体系中的四种dNTP的浓度应当相等，以使错误掺入率降至最低。适宜浓度的dNTP对于获得理想的PCR反应尤为重要。dNTP的浓度过高可加快反应速度，同时也增加了碱基错配率和实验成本；降低浓度可导致反应速度下降，但可提高反应的特异性。通常的PCR反应体系中，dNTP的浓度应在20~200?mol/L之间，在此范围内，PCR的产量、特异性和忠实性之间的平衡最佳。dNTP的浓度取决于PCR反应体系中的特定靶序列的长度，据此我们可以确定反应体系中的dNTP的最低适宜浓度。如在100?l反应液中，当每种dNTP的浓度为20?mol/L时，理论上可以扩增出2.6?g的400bp的DNA。有报道，应用每种浓度低至2?mol/L的dNTP可以成功的检出107拷贝的DNA分子中的一个ras点突变。但如此低浓度的dNTP在常规的PCR反应中应当避免，因为保持四种dNTP的浓度在其Km值(10~15?mol/L)以上，对保持碱基掺入的忠实性是极为重要的。当dNTP的浓度大于50mmol/L时会抑制Taq pol的活性。需要注意的是dNTP与Mg2+之间的浓度关系。因为dNTP中的磷酸基团可与Mg2+结合，使反应体系中游离Mg2+浓度下降从而影响DNA pol的活性。
6. 耐热DNA聚合酶：耐热DNA聚合酶在PCR反应中起着关键的作用，因此PCR反应体系中耐热DNA聚合酶的选择及其用量显得尤为重要。目前用于PCR的耐热DNA聚合酶已有多种，其中最常用的仍然是Taq DNA聚合酶。下面讨论的情况将以美国PE-Cetus公司生产的Taq DNA聚合酶为依据。Taq pol的活性对Mg2+、K+、NH4+等离子的浓度较敏感。Taq pol是Mg2+依赖性酶因而对Mg2+的浓度最为敏感。以蛙鱼精DNA为模板，dNTP的总浓度在0.7~0.8mmol/L，使用不同浓度的Mg2+进行反应10min，结果表明，Mg2+浓度在2.0mmol/L时酶的活性最高，若Mg2+浓度偏高时，则酶的活性将受到抑制。需要注意的是由于PCR反应体系中的模板DNA、引物以及dNTP均可与Mg2+结合，因此Mg2+浓度在不同反应体系中应适当调整。K+的最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时PCR反应明显受到抑制。50mmol/L的NH4Cl对Taq pol的活性中等抑制。50mmol/L的NaCl可以提高Taq pol的活性20%~30%。由于Taq pol没有校正阅读功能，在扩增过程中可引起碱基错配，通常可应用低浓度的dNTP(各20?mol/L)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq pol的忠实性。此时的平均错配率仅为5×10-6次/核苷酸循环(通常30次循环的Taq pol的错配率约为0.25%)。Taq pol在PCR反应体系中的加入量也很重要，若酶量过少会影响靶序列扩增产量，而过多则会导致非特异性的扩增。在其它参数最佳的时候，每100?l反应液中加入1~2.5U的Taq pol为最佳。然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。此外不同的变性剂对Taq pol的影响不同(如表1-1)，由于有时需要向PCR反应体系中加入一定浓度的DMSO、甲酰胺等作为PCR反应促进剂，以改善反应的扩增效率及特异性，因此，当PCR反应体系中存在Taq pol的抑制剂时，应适当的调整Taq pol的用量。另外不同厂家生产的酶的性能及质量也有所不同，因此在实际情况下应当根据PCR反应体系中特定的模板分子和引物、反应体系中的Taq pol抑制剂对不同厂家生产的不同批次的Taq pol进行优化。通常在100?l的反应体积中加入0.5~5U酶的范围内试验酶的最佳浓度。
目前，Taq pol仍然是常规扩增小片段DNA首选的耐热DNA聚合酶。然而在其它一些特殊情况下(例如当要求较高的PCR反应忠实性时，当待增模板DNA的长度超过数千碱基对时，或当使用RT-PCR技术克隆mRNA时)，其它耐热DNA聚合酶与Taq pol相比具有显著的优点。因此，我们应当根据具体实验的目的来选择特定的耐热DNA聚合酶。例如，当实验的目标是获取一个目的基因的真实拷贝时，就需要选择具有校正阅读功能的聚合酶；然而当实验的目标是克隆一个扩增产物时，能够产生平端切口的聚合酶也许是最佳的选择。然而，当两种或者更多的DNA聚合酶混合在一起使用时能够显著的提高PCR反应的扩增产量，尤其当反应模板核酸为长链DNA时更为明显。这可能是由于各种聚合酶功能上的互补作用使其能够更加容易的使引物延长链顺利地通过模板链上的各种潜在的障碍(包括模板链上的高度二级结构、缺乏末端转移酶活性的聚合酶无法连接的模板链缺口以及使无校正阅读活性的聚合酶停滞并与引物模板杂交链脱离的错配碱基对)。现在许多厂商出售混合配方的耐热DNA聚合酶，以获得在特定的反

表(1-1) 变性剂对Taq pol活性的影响
变性剂 浓度 活性 （%）
乙醇 ≤3%10% 100110
尿素 ≤0.5mol/L1.0mol/L1.5mol/L2.0mol/L 10011810782
DMSO ≤1%10%20% 1005311
DMF ≤5%10%20% 1008217
甲酰胺 ≤10%15%20% 1008639
SDS 0.001%0.01%0.1% 10510<0.1

应体系中所需要的性能。例如，Tbr和Taq聚合酶混合制剂(商品名为DyNA酶(MJ Research Inc.)，同时具有Tbr聚合酶的校正阅读功能和Taq聚合酶的高扩增效率的特性。相似的还有Taq和Pfu聚合酶的混合剂(商品名为Stratagene和Boehringer Mannheim)，能使长达35kb的长链模板核酸的PCR反应获得高产量的扩增产物。(表1-2)总结了几种常见的商品化的耐热DNA聚合酶的性能，以利于我们根据具体需要选择适合的聚合酶。
7. PCR反应促进剂：在有些情况下，可以向PCR反应体系中加一些助溶剂：例如甲酰胺(formamide)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、甘油(glycerol)和一些添加剂：如氯化四甲基铵(tetramethylammonium chloride，TMAC)、谷氨酸钾(potassium glutamate)、硫酸铵(ammonium sulfate)、离子化及非离子化的除垢剂等，以降低碱基错配率或提高PCR反应的扩增效率。这些助溶剂和添加剂即为PCR反应促进剂。大多数的PCR反应促进剂在高浓度时将会抑制PCR反应，见(表1-3)。因此在具体实验中应根据PCR反应体系中特定的模板DNA和引物的结合情况来决定PCR反应促进剂的最适浓度。通常在优化PCR反应体系时，应当首先考虑优化反应体系中的常规组成成分，尤其要考虑Mg2+和K+的浓度。
下面简要介绍几种常见的PCR反应促进剂的优化使用：
(1) DMSO：DMSO有变性DNA的作用，使用10%的DMSO对大肠杆菌DNA聚合酶Klenow I片断是有益的，但是对Taq DNA聚合酶有抑制作用，因此在一般反应中应尽量不用DMSO。然而，在复合PCR中可以用。
(2) 甘油：在反应体系中加入5%~20%的甘油有利于PCR反应中的复性，尤其对GC含量高和二级结构多的靶序列以及扩增片段较长的PCR反应中更为适用。但DMSO和甘油并非对所有的PCR反应都有益，应当根据实验的具体情况确定是否在反应体系中加入这些试剂。
(3) TMAC：在反应体系中加入1×10-4~1×10-5mol/L的TMAC可促进PCR反应，去除非特异性扩增而不抑制Taq DNA聚合酶。
(4) T4噬菌体基因32蛋白质(gp32)：向PCR反应体系中加入0.5~1?l的gp32(1mmol/L)可改善DNA聚合酶对长片段DNA的扩增。
(二) 循环参数
1. 变性：变性的温度取决于模板DNA分子的G+C含量和DNA聚合酶的热稳定性，而变性的时间与模板DNA链的长度及DNA聚合酶的热稳定性有关。在90℃~97℃的温度范围内，即使再复杂的DNA分子也可以变性成为单链。通常的变性温度和时间分别为95℃、30秒，有时用97℃、15秒。温度过高且时间
过长，Taq DNA聚合酶易失活且dNTPs破坏增多，从而对PCR反应产生不良影响。尽管DNA在其链分解温度(strandseparation temperature，Tss)时的变性只需几秒钟，然而要使反应管内部达到Tss还需要一定的时间，因此需要延长变性时

表(1-2)常见耐热DNA聚合酶的性能和使用条件
DNA聚合酶 供应商 来源 最适温度(℃) 外切酶活性 忠实性 稳定性(特定温度下活性保留时间) 缓冲液/pH(mmol/L) 盐浓度(mmol/L) 二价阳离子浓度(mmol/L) 其他附加成分
Taq DNA聚合酶 BM,LT,Pro,Start,P-E,T T.aquaticus 75~80 5'→3' 低 97.5℃，9min 10 Tris-HCl/8.3 50 KCl 1.5~5.0MgCl2 BSA,NP-40,Tween20
Stoffel片段 P-E T.aquaticus 75~80 无 低 97.5℃，21min 10 Tris-HCl/8.3 10 KCl 2.0~10.0MgCl2 BSA,Tween21
rTth DNA聚合酶 BM,ET,P-E T.thermophilus 75~80 5'→3' 低 95℃，20min 10 Tris-HCl/8.3 90 KCl -
Tfl DNA聚合酶 Pro T.flavus 70 无 低 70℃，120min 50 Tris-HCl/9.0或20 Tris-醋酸/9.0 20（NH4）2SO4,70 醋酸钾 DNA合成1.5~5..0 MgCl2，反转录酶活性1.5~5.0MnSO4 0.5%Tween20在Mn存在时有较强的反转录酶活性
Hot Tub DNA聚合酶 Amr T.ubiquitus 无 低 50 Tris-HCl/9.0 20（NH4）2SO4, 0.7~2.0MgCl2
Tbr DNA聚合酶 Amr,Finnz T.brockianus 75~80 5'→3' 低 96℃，150min 10 Tris-HCl/8.8 50 KCl 1.5~5.0MgCl2 Triton X-100
UlTma DNA聚合酶 P-E,Roche Thermotoga maritima 75~80 3'→5' 高 95℃，50min 10 Tris-HCl/8.8 10 KCl 1.5~5.0MgCl2 Tween20
rBst DNA聚合酶 ET Bacillus sterothermophilus 60~65 5'→3'，3’→5’
Isotherm Bst大片段 ET,Bio-Rad Bacillus sterothermophilus 60~65 低
Pwo DNA聚合酶 BM Pyrococcus woesei 60~65 3'→5' 高 100℃，>2小时 10 Tris-HCl/8.85 20（NH4）2SO4, 1.5~4.0MgSO4 BSA,不能用dUTP
Tli DNA聚合酶 Pro Thermococcus litoralis 70~80 3'→5' 低 100℃，100min 10 Tris-HCl/9.0 50 KCl 1.5~5.0MgCl2 Triton X-100
Deep Vent DNA聚合酶 NEB Pyrococcus strain GB-D 70~80 3'→5' 高 100℃，480min 20 Tris-HCl/8.8 10 KCl，10（NH4）2SO4, 1.5~5.0MgSO4 Triton X-100
Pfu DNA聚合酶 Start Pyrococcus furiosus 72~78 3'→5'' 高 95℃，240min 20 Tris-HCl/8.2 10 KCl，6（NH4）2SO4, 1.5~2.5MgCl2 BSA,Triton X-100
酶供应商：BM：Boehinger Mannheim，ET：Epicenter Technologies，LT：Life technologies，Pro：Promega，NEB：New England Biolabs，P-E：Perkin-Elmer，T：TaKaRa，Start：Stratagene，Amr：Amresco，Finnz：Finnzymes OY

表(1-3) 影响PCR反应的PCR反应促进剂的浓度
名称 抑制 促进
DMSO >10% 5%
PEG >20% 5~15%
甲酰胺 >10% 5%
甘油 >20% 10~15%
Tween 20 未测定 0.1%~2.5%

间。通常在加入耐热DNA聚合酶之前先使模板在97℃下变性7~10min，再按94℃或95℃的温度进入循环。通常G+C含量约为55%的线性模板DNA分子的变性温度和时间为94~95℃45秒。此外在实际情况下，应根据模板DNA分子中的G+C的含量，耐热DNA聚合酶(表1-2)以及模板链的长度适当的调整变性的温度和时间。例如，当待增靶序列中的GC含量较高时，可以适当的提高变性温度或延长变性时间以利于模板DNA充分变性；当扩增较长的模板DNA时应当适当延长变性时间以保证模板DNA彻底变性；而扩增100~300bp的短片段时，可用简便、快速的两步PCR法，同时在5~10个循环后，可将变性温度降至87℃~90℃以改善PCR的产量。此外，由于环状DNA复性太快，通常待扩增的环状质粒DNA模板在扩增前最好先酶切线性化。为防止PCR反应液在变性温度下蒸发，可在反应管中加入1~2滴液体石蜡。
2. 退火：退火的温度取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的退火温度对于PCR的特异性尤为重要。一般来说，较低的退火温度可提高PCR反应的敏感性但其特异性较差，而较高的退火温度则可提高PCR反应的特异性但却降低了其扩增效率。合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。通常引物与模板的退火温度在45~55℃之间，一般情况下在Tm值允许的范围内选择偏高的退火温度以提高PCR反应的特异性。PCR反应体系的实际退火温度应根据所要求的PCR反应的特异性和灵敏度做出相应的调整。尽管有很多的公式可以用于计算引物的Tm值，然而这些公式并不是对所有长度的引物都适用，即对于每一特定引物我们并不能精确的计算出其Tm值。因此，优化退火温度的最理想的方法是设置一系列的对照反应。即通过在低于计算出的引物Tm值2℃到10℃的温度范围内进行退火的一系列平行反应来确定最佳退火温度。此外我们还可以通过在低于计算出的引物Tm值2℃到10℃的范围内由高到低的设定同一反应体系中连续的不同循环的退火温度从而确定最佳退火温度，这种方法避免了同时作多个平行实验的繁琐操作，并且避免了由于各平行实验中实验条件的差异带来的误差。在实际应用中不少研究者使用降落PCR的方法来确定最佳退火温度。退火温度一旦确定，退火的时间并不是关键性的因素，但退火时间太长会增加非特异性的复性从而降低反应的特异性，此外退火时间也不能太短，否则将导致引物模板复性不完全。
3. 延伸：尽管耐热DNA聚合酶可在较宽的温度范围内催化合成DNA，但是不合适的延伸温度仍可对扩增产物的特异性和产量造成影响。延伸温度取决于所使用的耐热DNA聚合酶的最适作用温度，一般为70~75℃。耐热DNA聚合酶在最适作用温度下可以获得最大的碱基掺入率，然而DNA聚合酶的碱基掺入率还受到所用的缓冲溶液、pH值、盐浓度、模板DNA性质的影响。当使用Taq DNA聚合酶时，通常延伸温度设定为72℃。延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度，在72℃时，Taq DNA聚合酶的碱基掺入率为35~100bp/秒，因此延伸速率为1kb/分。通常扩增1kb以内的DNA片段延伸1min即可，而当待增序列长达3~4kb时，则需延长3~4min；然而当扩增小于150bp的片段时则可以省略延伸步骤，因为在退火温度下Taq DNA聚合酶的活性已足以完成靶序列的合成。通常在PCR的最后一轮循环中可以适当的将延伸时间延长至4~10min，以使PCR反应完全提高扩增产量。此外在实际操作中，应注意在前几轮循环中的延伸时间要足够，以使靶序列延伸完全从而提高PCR反应的特异性。此外当待扩增DNA的浓度较低时，由于碱基掺入率较低，可适当的延长反应延伸时间。
4. 循环次数：PCR反应的循环次数和引物延伸效率决定着PCR反应的扩增程度。在其它条件已经优化的前提下，PCR反应的循环次数取决于待增靶序列的初始浓度。例如，当待增靶序列数分别为3×105、1.5×104、1×103和50拷贝分子时，最适循环数分别为25~30、30~35、35~40和40~45次。在PCR反应中，当扩增双链DNA中的一个小片段时，从第三次循环中扩增所需要的平端片段第一次出现开始，扩增产物依公式Nf=No(1+Y)n呈指数的形式积累，即PCR反应指数期。公式中Nf是靶序列的最终拷贝数，No 是最初拷贝数，Y是每轮循环的引物的延伸效率，n是扩增条件下的PCR循环数。在大多数情况下，一旦目的片段的最终拷贝数达到1012后，每次循环的效率就开始急剧的降低，此后产物不再以指数形式积累，PCR反应指数期终止。由于每一循环引物的延伸效率取决于反应体系中的耐热DNA聚合酶的性质，因此效率降低表明DNA 聚合酶已成为反应的限制因素。在PCR反应指数期内待扩增序列得到了最大限度的扩增，并且此期内靶序列的非特异性扩增极少并几乎可以忽略，而在此期以外的非指数期的PCR常常会导致非特异扩增、小的缺失或突变体的出现。因此PCR的许多应用都严格要求在PCR的指数期完成。一般情况下循环次数在25~40次之间，循环次数过多将导致非特异性扩增产物的增加，降低PCR反应的特异性；而循环数过少又会使PCR反应产量过低。在实际应用中，1012拷贝的特定序列足以满足分子生物学的绝大多数应用。同时，许多的实验室研究了PCR所用的不同的DNA聚合酶的效率(表1-4)，故只要知道反应体系中靶序列的最初拷贝数，就可以根据上述的公式计算出使最终拷贝数达到1012所需要的循环数。
(三) 其他因素
1. 热起动(hot start)：在PCR反应的第一次循环时，反应体系从较低的温度开始升温，由于耐热DNA聚合酶具有较广的作用温度范围，即在较低的温度下耐热DNA聚合酶仍然具有活性，而在反应体系加热的过程中，可能发生模板与引物的非特异性配对，这些非特异性配对可能在较低的温度下由耐热DNA聚合酶在其3’端加上几个碱基形成相对稳定的非特异性引物，在其后的扩增反应中，这些非特异性产物反复大量扩增，最终导致PCR反应严重失败。为了消除这种非特异性的扩增，可以采用热启动的方式，使耐热DNA聚合酶仅在反应体系达到较高的温度(>70℃)时才发挥作用。这种方法可以大大的提高PCR反应的特异性和敏感性。此外，由于在扩增前加热可以促进引物特异性复性和延伸从而增加了有效引物的长度，故可以减少引物二聚体的形成和引物的自我复性。热起动的方法有几种：一种方法是在PCR反应系统中加入抗耐热DNA聚合酶抗体。抗体与耐热DNA聚合酶结合后，抑制耐热DNA聚合酶的活性。因此，在反应开始时，在较低温度下，虽然可能发生引物和模板的错配，但由于DNA聚合酶没有活性，不会引起非特异性的扩增。此后反应体系温度继续升高，当模板核酸热变性时，抗体在高温下失活，此后耐热DNA聚合酶释放，并在后续的延伸反应中发挥作用，介导特异性的DNA聚合反应。另一种方法使用石蜡将耐热DNA聚合酶与PCR反应系统分隔，因此在较低温度下也不会发生非特异性扩增。当反应体系升温达到热变性温度时，石蜡融化，耐热DNA聚合酶与PCR反应体系混合，从而在以后的步骤中发挥作用。
2. 石蜡油：向反应体系中加入石蜡油的目的是防止反应液蒸发后引起反应体系的体积和成分的改变。石蜡油必须是高质量、无菌的，不能含有抑制PCR反应的成分和污染物。加入的石蜡油的体积要求不太严格，通常以盖住反应液液面为度。
(四) 反应体系中各因素间的相互作用
PCR的循环参数、反应体系中各组分及其它反应条件都是相互影响的，任何因素的改变都将引起其它反应条件的变化，从而直接影响PCR反应的结果。因此PCR反应的结果是以各种反应条件为自变量的多元函数。由于各种不同反应体系都有其最适反应条件，故只有PCR反应体系在最适反应条件下，方能达到最佳扩增结果。

表(1-4) 常见耐热DNA聚合酶不同条件下的效率、错误率和最适循环数
酶 dNTP(mmol/L) pH Mg2+(mmol/L) 每循环的效率(%) 错误率(错误/掺入碱基对) PCR引起的突变 需要的循环数
pfu 0.1 8.4 1.5 60 7×10-7 0.3 30
Vent 0.5~1.5 85 75 70 4.5×10-5 16 26
Taq 0.5~1.5 8.0 5 36 7.2×10-5 25 45
Taq 16.6 8.8 10 88 2×10-4 56 22

二、 PCR反应的忠实性
PCR反应的忠实性即PCR扩增反应的产物的核酸序列应当与待增靶DNA分子的序列高度一致。PCR反应的忠实性是衡量一个PCR反应体系的扩增效率的重要指标之一，因此了解PCR反应的忠实性的特点及其影响因素是极其重要的。
(一) PCR反应的特异性、忠实性和扩增效率的关系
特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。特异性指PCR反应的扩增产物之间的一致性，即反应扩增产物的序列是相互一致的。高度特异的PCR反应要求扩增产物中可以检测到的非特异性扩增尽可能少。忠实性指扩增产物的序列与模板DNA的序列相符合的程度。高度的忠实性即PCR扩增产物中几乎没有由DNA聚合酶引起的碱基错配。理想的PCR反应应当是高度特异和忠实的。然而，由于常用的耐热DNA聚合酶没有Klenow片段的校正阅读功能，因此虽然在合理控制反应条件的前提下可以使PCR反应获得高度特异性却不能避免由于耐热DNA聚合酶的特性决定的碱基错配，故有高度特异性的PCR反应的忠实性不一定高。此外，PCR反应体系中的各种成分、循环参数等众多因素都影响着PCR反应的忠实性、特异性和扩增效率，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性以及高产量所需要的反应条件并不一致，因此在具体的PCR反应中应优先考虑对预期结果最为重要的参数，在此前提下优化反应条件。例如，在对细胞的均一群体的直接序列分析中，PCR反应的产量和特异性比忠实性更重要，而在研究个别DNA分子或者不均一群体中的稀有突变中，PCR反应的忠实性就显得比其他两个参数重要的多了。
(二) 影响PCR反应的忠实性的因素
PCR反应体系中的各种组成成分以及循环参数等诸多因素对PCR反应的忠实性都有不同程度的影响，其中最为显著的是模板数、dNTP浓度以及聚合酶的种类等。
1. 模板核酸浓度：由于一旦由聚合酶引起的碱基错配被引入，这些错误序列将随着模板的“正常序列”一起呈指数形式扩增。因此，由聚合酶引起的错误序列所占的比例将随着扩增循环数的增加而增大。当使用微量模板DNA进行PCR反应时，将大大的增加由聚合酶引起的错配序列的比例从而影响PCR反应的忠实性。例如，使用Taq pol进行PCR反应，Taq pol的碱基错配率约为10-4。当进行PCR反应的模板数仅为10个拷贝时，虽然碱基错配的发生概率并不高(10-3)，然而一旦发生碱基错配，这种错配将占PCR终产物的10%。而使用大量的模板DNA(105)后，虽然在PCR的第一个循环中将可能引起10个碱基错配(聚合酶仍为Taq pol)，而这些错配只占PCR终产物的1/105。因此，通常在反应体系中加入的模板数应为102~105拷贝。
2. dNTP浓度：研究表明，当反应体系中的dNTP浓度明显低于Km值(dNTP<1?mol/L)或者某一dNTP的浓度低于其它三种的浓度时会增加错配碱基的掺入。由于聚合酶对错误终端的延伸主要依赖于Km值的识别，因此这些错误掺入的碱基有利于链的终止从而有助于保持反应的忠实性。然而，当dNTP浓度过高(>1mmol/L)时则会促进错配碱基的延伸。因此，在PCR反应体系中应采用较高浓度的dNTP，且四种dNTP的浓度应相同。通常，当每种dNTP浓度为10~50?mol/L时，能够最大程度的保持PCR反应的忠实性。
3. 耐热DNA聚合酶：尽管通过优化反应体系中的缓冲液、靶序列等反应条件可以大幅度的提高由Taq、T7和Vent DNA聚合酶介导的PCR反应的忠实性，但是其忠实性还是远差于pfu和T4聚合酶的水平，且聚合酶的一些内在性质对PCR反应的忠实性也有较大影响。因此当对PCR反应的忠实性要求较高时，最好应用具有校正阅读活性的聚合酶。
此外反应体系中的缓冲液等其它反应条件也对PCR反应的忠实性有着较大的影响。在具体的反应中，应根据具体情况优化模板DNA、dNTP、耐热DNA聚合酶和缓冲体系等反应条件，力求最大程度的保持PCR反应的忠实性。
三、 平台效应
在PCR反应的后期扩增产物的增加因呈指数方式而变成平坦的曲线，同时出现大量的非特异性扩增，这种现象称为平台效应。平台效应可能与下列因素有关：
1. 随着反应的进行，dNTP和引物的浓度不断的降低。
2. 随着产物的增加，酶对模板的比率降低。
3. 由于变性温度较高，多次循环后酶的活力和dNTP的稳定性逐渐降低。
4. 反应体系中产生的非特异性产物或引物二聚体与反应底物竞争聚合酶。
5. 反应产物在高浓度时变性不完全，影响引物的延伸。
6. 当产物浓度高于10-8mol/L时，可能降低Taq聚合酶的延伸加工能力或引起产物链的分支迁移和引物转换。
7. 酶与PCR的产物结合，使酶分子减少。
因此我们应当控制PCR的循环次数在合理的范围，使反应在指数扩增期内完成。
第五节 PCR产物的检测
PCR反应完成后，必须通过严格的检测分析以确定是否得到准确可靠的特定扩增产物。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法，在具体实验中我们可以根据具体研究对象和研究目的以及具体实验条件而采用不同的检测法。常见的PCR产物的检测分析法有凝胶电泳法、核酸探针杂交法、酶谱分析法、DNA酶免疫试验法、PCR-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)、颜色互补分析法、序列分析法、PCR-HPLC法、单一核苷酸引物延伸法(SNUPE)、PCR-寡核苷酸连接检测法(PCR-OLA)和单链构型多肽性分析法等。