巴傲得生物-WB实验流程
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凝胶浓度与蛋白质分离范围
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凝胶浓度％ （W/V ） |
最适分离范围（KD ） |
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7.5 |
70-200 |
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10.0 |
50-150 |
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12.0 |
30-100 |
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15.0 |
12-45 |
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20.0 |
4-30 |
不同浓度分离胶的制备（两块胶）
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组分 |
7.5 ％ |
10 ％ |
12 ％ |
15 ％ |
20 ％ |
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Tris-HCL 缓冲液 |
3.75ml |
3.75 ml |
3.75 ml |
3.75 ml |
3.75 ml |
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蒸馏水 |
7.28 ml |
6.03 ml |
4.95 ml |
3.45 ml |
1.0ml |
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丙烯酰胺溶液， 30 � |
150.0 μ l |
150.0 μ l |
150.0 μ l |
150.0 μ l |
150.0 μ l |
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过硫酸胺， 10 � |
150.0 μ l |
150.0 μ l |
150.0 μ l |
150.0 μ l |
150.0 μ l |
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TEMED |
15.0 μ l |
15.0 μ l |
15.0 μ l |
15.0 μ l |
15.0 μ l |
4 �浓缩胶的制备（两块胶）
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组分 |
体积 |
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Tris-HCL 缓冲液 |
1.25 ml |
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蒸馏水 |
3.05 ml |
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丙烯酰胺溶液， 40 � |
0.67ml |
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SDS ， 10 � |
50 μ l |
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过硫酸胺， 10 � |
50.0 μ l |
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TEMED |
10.0 μ l |
一 试剂配制：
1 10%APS
1g 溶于 10ml 水，小管装，外包铝箔
2 Tris HCl （ ph8.8 ） 1.5M
18.171g Tris-base 溶解到 60ml 水，调节 PH 为 8.8 ，定容到 100ml
3 Tris HCl （ ph6.8 ） 0.5M
6.057g Tris-base 溶解到 60ml 水，调节 PH 为 6.8 ，定容到 100ml
4 10 × TBS PH7.6
NaCl 80g
Tris-base 24.2g
HCl 调 PH 到 7.6 ，超纯水定到 1L
5 TBST （现用现配） 存放于 4 度冰箱
10 × TBS 50ml ； 450ml 水； 500 微升 Tween-20
6 2 × Loading Buffer 100ml
0.5M Tris HCl （ ph6.8 ） 20ml; 甘油 20ml; 10%(W/V) SDS 40ml; 2- β - 巯基乙醇 10ml; 0.1%(W/V) 溴酚蓝 5ml; ddH2 O 5ml 。
7 10 × Transfer Buffer 1L
144g Glycine
30.3g Tris-base
定容到 1L , 用时稀释到 1 ×
8 10× SDS Buffer 1L
144g Glycine
30.3g Tris-base
10g SDS
定容到 1L , 用时稀释到 1 ×
9 封闭液
5% （ W/V ）脱脂奶粉，用 TBS 稀释
10 一抗稀释液
2% （ W/V ） BSA ，用 TBST(0.1% （ V/V ） Tween-20) 稀释
11 二抗稀释液
2% （ W/V ）脱脂奶粉，用 TBST(0.1% （ V/V ） Tween-20) 稀释
二 提取蛋白：
1 把培养皿置于冰上，倒掉培养液，并用 PBS 洗涤细胞，然后弃去洗液。
2 将 1ml 细胞裂解液（配方如下所示）加入培养皿，晃匀置于冰上 30min ，每 5min 晃一次。
3 裂解完后，用干净的刮子将细胞刮于培养皿的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
4 将收集下来的细胞于 4 度下 12500rpm 离心 15min 。
5 将离心后的上清加入等体积的 2 × loading buffer ，煮沸 5min 。
1ml 细胞裂解液：
0.5ml 水
0.5ml 裂解液
10µl 蛋白酶抑制剂
10µl Na2VO3 （ 100mM ）
1µl 胃蛋白酶抑制剂（ pepstatin ）
其中：
一， 2× 裂解液（ calbiochem ） 100ml
NaCL ： 1.578g
β-gly ： 1.08g
Tris ： 0.485g
EDTA ： 0.1489g
sp （焦磷酸钠）： 0.1784g
DTT( 二硫代苏糖醇 ) ： 0.0617g
Triton-100 ： 2ml
甘油： 20ml
HCL 调 pH 至 7.5 ，定容至 100ml
二，蛋白酶抑制剂
亮肽酶素（ leupeptin ）： 1mg/ml （用水溶解，终浓度 1µg/ml ）
抑酞酶（ aprotinin ）： 1mg/ml （用水溶解，终浓度 1µg/ml ）
即，将 1mg leupeptin 与 1mg aprotinin 溶解在 1ml 水中，稀释 10 倍后分装（ 20µl 一管）并储存于 -20 度，每用一次拿出一管。
三，胃蛋白酶抑制剂（ pepstatin ）：
1mg/ml （用乙醇溶解，终浓度 1µg/ml ），储存于 -20 度。
四， Na2VO3 储存于 4 度。
三 煮样
将等体积的 2 × Loading Buffer 加入到细胞裂解液中（即， 2 × Loading Buffer ：样品 =1 ： 1 ），在沸水浴中煮沸 5min ，防止爆盖。煮沸后在离心机上瞬时甩一下，保证样品充分混匀。
四 电泳
浓缩胶 4% ，分离胶 12% （小分子为： 15% ）；
电泳： 85V 跑至 marker 出现分离， 135V 溴酚兰刚跑出胶板。；
五 转膜
转膜：恒流 0.35A ， 100min ， 0.45 微米孔径的 NC 膜，（小分子为：恒流 0.3A ， 60min ， 0.22 微米孔径的 NC 膜）；要在冰浴中进行（转移前将胶和膜在转移缓冲液中浸泡 20min ）。
注意：转膜时两份滤纸不能接触，否则会短路，电流不会过胶和膜！
六 封闭
5% 脱脂奶粉（ TBS 配置）；室温 1 小时；
TBST 洗膜 3 次，每次 5min 。
七 孵育一抗
1 ： 500 （ 2%BSA 的 TBST 配制）， 4 度过夜；
TBST 洗膜 3 次，每次 5min 。
八 孵育二抗
羊抗兔，荧光二抗（ 1 ： 5000 ， 2% 奶粉 TBST 配制）；室温 1-2 小时避光；
TBST 洗膜 3 次，每次 5min, 最后超纯水洗膜 1 次， 5min 。
