PCR常见问题及回答

一、RT-PCR
1. cDNA产量的很低
可能的原因：


2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。


3. 产生非特异性条带


4. 产生弥散（smear）条带


5. 产生大分子量的弥散条带


6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果


7. 扩增产物滞留在加样孔中


8. SSⅢ与SSⅡ有何不同？
SuperScriptⅢ反转录酶

9. 为什么有人更喜欢用SSⅢ而不是ThermoScript？
ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低，SSⅢ则更稳定。


10. 为什么使用基因特异性引物（GSP）？
GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。


11. 什么情况下需要使用RNase H？
在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时


12. 根据不同的目的选择不同的系统：
目的 建议
RT与PCR使用不同的引物
或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统
高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统
高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统
或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统
高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统
长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果
含Elongase酶的一步法RT-PCR系统

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二、Generacer
1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：


2. 为什么得不到RACE产物？


3. RACE的PCR结果有杂带
RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：
注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。


4. 得不到全长的5’RACE PCR产物


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三、PCR

在进行PCR时：


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四、引物
1. 应该选择哪种纯化方法？
取决于实验目的和引物的长度


2. 为什么我订购了50nmol，但是收到却只有40nmol？
50nmol是起始量


3. 怎样制备100μM的储液？
体积（μl）=质检报告上的nmol数目×10


4. 怎样设计引物？


5. 引物序列有插入或缺失？


6. PCR无结果？